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mica
Yenny Paulet Romero Galindo
NIVELES BSICOS DE INFORMACIN
BIOLGICA:

Genoma: la informacin gentica comn a todas

las clulas del organismo.

Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa

en una clula en una etapa especfica de su
desarrollo. Conjunto completo de transcritos.

Proteoma: las protenas que interactuan para dar a

Transcript
mica
Estudio de los perfiles de
expresin de todos los genes
presentes en el genoma.
 TRANSCRIPCIN

DNA
G T AAT C C T C
| | | | | | |
| | C ATTAG
GAG
RNA
polimerasa

C C
A U
mRNA U A
G
REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

Varios niveles de regulacin: transcripcin,

maduracin, transporte al citoplasma,
degradacin, traduccin, post-traduccin.

Los genes no actan de forma aislada.

Existen redes de interaccin:

Fsica (directa o indirecta).
Funcional.
SISTEMAS DE DETECCIN DE LA EXPRESIN GNICA
Pasado: tcnicas tradicionales para medir la
expresin gnica, como Northern y RT-
PCR.

Desarrollo tecnolgico:
Expressed Sequenced Tags (ESTs).
Serial analysis gene expression (SAGE).
Suppression substractive hybridization
(SSH).
TECNICAS GENMICAS DE ALTA PROCESIVIDAD

Independientes de conocimiento previo:

ESTs
SAGE
SSH

Dependientes de conocimiento previo:

Microarrays de DNA
 ESTS
(EXPRESSED SEQUENCED TAGS)
Generacin de colecciones de ESTs
(etiquetas de secuencia expresadas).

La complejidad de los genomas eucariotas

hace aconsejable no abordar inicialmente el
estudio del genoma completo.

Es preferible estudiar aquellos genes que se

estn expresando en un momento
determinado de la vida del organismo.
ESTS
 ESTS
Genoteca de cDNA: coleccin de fragmentos
de DNA clonados que representan el conjunto
de genes que se estn expresando en un
rgano o tejido determinado, o bajo una
situacin particular o momento de desarrollo.

Las genotecas de cDNA se secuencian de

forma masiva para generar miles de
secuencias parciales o ESTs de 200-500 bp.
ESTS
 ESTS
Las diferencias en la expresin de genes pueden ser
identificadas considerando el nmero de veces en
que aparece representada una EST particular.

Las ESTs por su propia naturaleza, son incompletas y,

hasta cierto punto, imprecisas.

Las ESTs tambin suelen ser suficientes para la

identificacin de los genes mediante comparacin con
las bases de datos.
 TECNOLOGA SAGE
(Serial Analysis Gene Expression)
Versin acelerada de la secuenciacin de ESTs.

Un segmento corto procedente de un mRNA (etiqueta

SAGE) es suficiente para identificar inequvocamente a un
gen completo.

La etiqueta corta tiene que estar ubicada en una posicin

definida dentro de la secuencia del mRNA.
 TECNOLOGA SAGE
Generacin de etiquetas SAGE (Tags) de secuencias
(10-14 bases).

Ligacin de las etiquetas SAGE para obtener

concatmeros que pueden ser clonados y secuenciados.

Comparacin de los datos de secuencia para determinar

diferencias en la expresin de los genes.
TECNOLOGA SAGE
TECNOLOGA SAGE
TECNOLOGA SAGE
 TECNOLOGA SAGE: VENTAJAS
Principalmente los ESTs brindan informacin de secuencia,
mientras que el SAGE provee datos cuantitativos
describiendo la abundancia de transcritos.

Determina el nivel de expresin para cada gen, y

contribuye al descubrimiento de nuevos genes.

Muy buena correlacin con la abundancia de RNA

mensajero en la clula.
 TECNOLOGA SAGE: PROBLEMAS
Muy laborioso, laboratorios especializados y
complejidad anlisis de datos.

Problemas tcnicos:
Digestin incompleta con la enzima que genera
extremos cohesivos.

Problemas con la secuenciacin masiva.

MICROARRAYS DE
DNA
 MICROARRAYS DE DNA
Los microarrays de DNA surgen de la necesidad de
analizar la cantidad de informacin procedente de los
grandes proyectos de secuenciacin de genomas.

Permiten elaborar mapas finos de transcripcin y

proporcionan informacin indirecta de los niveles de
protenas.
 MICROARRAYS DE DNA
Permite estudiar simultneamente la expresin de miles de genes y
analizar su expresin bajo distintas condiciones experimentales.

Los microarrays de DNA constan de miles de conjuntos ordenados

de molculas de DNA de secuencia conocida depositados en un
soporte slido (~ 2 cm2) como cristal, nylon o silicio.

Cada combinacin (gen/muestra) se localiza de forma inequvoca en

un punto del microarray.
 Los microarrays de DNA permiten la medida simultnea de los
niveles de expresin de miles de genes (sondas) en un solo
experimento de hibridacin con una mezcla compleja de DNA o
RNA (dianas).

Sondas: secuencias de DNA conocidas (oligonucletidos o

productos de PCR) inmovilizadas ordenadamente sobre una
superficie slida.

Dianas: muestra problema de DNA o RNA marcada cuya

abundancia ser determinada por hibridacin.
Medir el nivel de transcritos (mRNA) de un gran nmero
de genes simultneamente para determinar que genes
se estn expresando en la clula.

CELL

RNA
 El objetivo de los experimentos con microarrays de DNA es
comparar la expresin de mltiples genes (transcripcin) en
distintas condiciones:
Momentos distintos del tiempo
Tejidos distintos
Tejidos sanos o enfermos (p.e. Tumores)

Se basan en tecnologas conocidas como la hibridacin y

la fluorescencia.
MICROARRAYS DE DNA - HIBRIDACIN
A T
A T
G C G C
C G C G
A T A T
C G C G
T A T A
G C G C
T A T A
A T A T
MICROARRAYS DE DNA - HIBRIDACIN
Mediante hibridacin, pueden detectar DNA o RNA:

Si el DNA o RNA hibridado

est marcado
fluorescentemente puede ser
cuantificado mediante
escaneado del chip de DNA.
 Cada sonda del microarray de DNA est diseada
para unirse a un gen de forma especfica.

Diseo de sondas especficas:

Especificidad de secuencia.
Tms homogneas.
Sin estructuras secundarias.

Cada sonda est dispuesta de forma ordenada sobre

el microarray de DNA.
MICROARRAYS DE DNA EL PROCESO

gen

mRNA

cDNA marcado
Sondas de DNA
 Los microarrays de DNA estn formados por 100 - 1
milln de sondas de DNA sobre una superficie de
1 cm por 1 cm (chip de DNA).

Los resultados de microarrays de DNA se basan en el

concepto de culpable por asociacin.

Genes que son co-regulados (patrn similar de

comportamiento) es probable que estn
funcionalmente relacionados formando parte del
mismo proceso biolgico.
EL PRIMER MICROARRAY DE DNA
45 Genes de Arabidopsis y 3 genes control:
total 48 seales.

Schena et al., (1995). Quantitative monitoring of gene expression

patterns with a complementary DNA microarray. Science 270, 467-470.
MICROARRAYS DE DNA EXPERIMENTO BSICO
GENE EXPRESSION PROFILING
PREDICTS CLINICAL OUTCOME OF
BREAST CANCER
LAURA J. VAN 'T VEER1,2, HONGYUE DAI2,3, MARC J. VAN DE VIJVER1,2, YUDONG D. HE3,
AUGUSTINUS A. M. HART1, MAO MAO3, HANS L. PETERSE1, KARIN VAN DER KOOY1,
MATTHEW J. MARTON3, ANKE T. WITTEVEEN1, GEORGE J. SCHREIBER3, RON M.
KERKHOVEN1, CHRIS ROBERTS3, PETER S. LINSLEY3, REN BERNARDS1 AND STEPHEN H.
FRIEND3

DIVISIONS OF DIAGNOSTIC ONCOLOGY, RADIOTHERAPY AND MOLECULAR CARCINOGENESIS AND CENTER

FOR BIOMEDICAL GENETICS, THE NETHERLANDS CANCER INSTITUTE, 121 PLESMANLAAN, 1066 CX
AMSTERDAM, THE NETHERLANDS
ROSETTA INPHARMATICS, 12040 115TH AVENUE NE, KIRKLAND, WASHINGTON 98034, USA
THESE AUTHORS CONTRIBUTED EQUALLY TO THIS WORK

NATURE, JANUARY 2002

Dos grupos distintos de
tumores aparentes sobre la
base del conjunto de ~ 5.000
genes significativos.
En el grupo superior slo el
34% de los pacientes eran de
metstasis grupo desarrollar
dentro de los 5 aos.
En el grupo inferior al 70%
de los pacientes tenan
enfermedad progresiva.
La agrupacin detecta dos
subgrupos de cncer que
difieren en el estado del RE y la
infiltracin linfoctica
Transcriptomics - 13349
Transcriptome - 40568
Transcriptome AND klebsiella - 30
Transcriptome AND klebsiella AND pneumoniae - 25