2.

ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS

PROTENAS
PURIFICACIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA
DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO

PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR DESALADO

Qu es una protena?.....
Una protena es

Es una macromolcula compuesta por una o mas

cadenas polipeptdicas, cada una compuesta por una
secuencia caracterstica de aminocidos unidos por
enlaces peptdicos. (Principios de Bioqumica, Lehninger)
Qu funciones
tienen las
protenas?
Las funciones biolgicas de las protenas
Las protenas tienen diferentes funciones:

Enzimas (Actividad cataltica)

Receptores de membrana

Acarreadores de membrana (Reconocimiento,

actividad cataltica y transporte)

Estructurales (Andamios moleculares)

Hormonas

Anticuerpos

Transporte
Purificacin de Protenas
La purificacin de protenas es un proceso mediante el
cual se separa una protena a partir de una mezcla
compleja.

Para la purificacin se toman en cuenta las propiedades

fisicoqumicas y se hace mediante mtodos de
cromatogrficos en un proceso paulatino.

El mtodo de purificacin debe disearse tomando en

cuenta la cantidad de protena que queremos obtener
(rendimiento). Este rendimiento depende del uso que se le
desea dar.

Podemos obtener la protena en estado nativo o

desnaturalizado dependiendo la finalidad de la
purificacin:

Las protenas se pueden purificar para
diferentes finalidades:

Investigacin
Estudiar su funcin biolgica.
Evaluar la estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria de las protenas.
Hacer anlisis filogenticos.
Analizar la relacin estructura-funcin.

Biotecnologa
Aplicaciones mdicas.
Aplicaciones teraputicas.
Suplementos alimenticios
Detergentes y limpiadores.
Cosmticos
Pasos para purificar una protena
Para qu purificar la protena:
Actividad
Concentrarla
Purificarla
Propiedades de la protena:
Masa Molecular
Punto Isoelctrico
Solubilidad
Estabilidad

De donde vamos a obtener la

protena:
Localizacin subcelular
Tejido
Organismo

Que tcnica vamos a usar para

purificar. (Dependiendo de que
queremos analizar)

Cuidados de la muestra
durante la purificacin.
Para purificar la mayor cantidad de protena se requiere tomar en
cuenta varios aspectos como:

El tejido del cual vamos a obtener la protena.

La eleccin debe tener en cuenta tres aspectos importantes:
1. Disponibilidad. Cantidad de tejido necesario para obtener
suficiente protena.

2. Cantidad de protena. Cuanta protena de inters encontramos

en el tejido que vamos a analizar.
Para obtener un mayor rendimiento se necesita:

Rendimiento y Pureza

Por lo que

Degradacin y Desnaturalizacin
Propiedades de la protena

Masa Molecular: Conocer el tamao de la protena es importante cuando

hacemos un gel SDS-PAGE o mtodos cromatogrficos para purificar la
protena como filtracin en gel.

Punto Isoelctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar

adecuadamente el buffer a utilizar o tcnicas como precipitacin
isoelctrica o cromatografa de intercambio inico.
Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las protenas,
tales como la composicin de aminocidos, la estructura tridimensional y
factores externos como pH, temperatura, fuerza inica.

Estabilidad: Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son

importantes para la purificacin, en trminos de agregacin, actividad,
etc.
Polaridad: La hidrofobicidad de la protena nos permite seleccionar
tcnicas de purificacin como columnas de interaccin hidrofbicas o en
aspectos de extraccin de protenas.

Uniones especficas: Algunas protenas tienen unin a ligandos que

permiten usar tcnicas de purificacin como la cromatografa de
afinidad.
Tcnicas de purificacin segn las propiedades
de las protenas:
Solubilidad:
Precipitacin.

Carga inica:
Cromatografa de intercambio inico.

Tamao Molecular:
Electroforesis en gel.
Centrifugacin diferencial.
Dilisis.
Cromatografa de filtracin en gel.

Polaridad:
Cromatografa de interaccin hidrofbica.

Uniones especficas:
Cromatografa de afinidad.
Mtodos generales para obtencin de protenas:

1. Ruptura del material

2. Obtencin del material libre de clulas (extracto proteico)

3. Precipitacin (sales, pH, alta temperatura, solventes

orgnicos)

4. Concentracin (dilisis o ultracentrifugacin)

5. Fraccionamiento cromatogrfico.
1. Ruptura del material.
. Lisis celular. Consiste en suspender las clulas en una solucin
hipotnica. Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de
la clula, causando hinchamiento y ruptura.

. Destruccin mecnica.
Homogenizacin: hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn
de vidrio que ajustan casi totalmente.

Mortero: moler en un mortero usando arena o almina.

Molino con piedras de vidrio.

Prensa de French: hacer pasar las clulas a gran velocidad a travs

de un pequeo orificio.

Sonicacin: Someter las clulas a vibraciones ultrasnicas.

. Congelacin y descongelacin. La rotura se produce al someter las

clulas a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a
-196C (usando nitrgeno lquido) y pasndolos rpidamente a
temperatura ambiente (25C).
 Amortiguador de lisis
Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas
durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones
tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo
ms corto posible.
Para ayudar a mantener las condiciones apropiadas e incluso mejorar la
estabilidad de una protena un buffer de lisis debe tener las siguientes
caractersticas:
pH
Mantener el pH en el cual la protena es
estable y previene la precipitacin
isoelctrica.

Fuerza Inica
Mantener la concentracin de sales
adecuada para reducir las prdidas por
precipitacin.

Aditivos
Son componentes que previenen la
degradacin y mejoran la estabilidad. Slo
se agregan sin son necesarios y bajo las
condiciones de la extraccin.
Agentes quelantes.
Detergentes
Inhibidores de proteasas.
Algunos Aditivos segn el tipo de protena
2. Obtencin de material libre de clulas (extracto
proteico)

El resultado de los tratamientos de lisado u homogenizado

contiene una mezcla de enzimas membranas y clulas rotas.

Esta mezcla se somete a centrifugacin para eliminar los restos

celulares y separar el sobrenadante, que contiene las protenas
solubles.

El extracto soluble con o sin detergente constituye el extracto

crudo donde se encuentra la protena de inters.

A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que

la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y
asegurarse siempre que los rotores estn fijos.
3. Precipitacin
Qu propiedad de la protena es importante en la
precipitacin?
Masa Molecular: Conocer el tamao de la protena es importante cuando
hacemos un gel SDS-PAGE o mtodos cromatogrficos para purificar la
protena como filtracin en gel.

Punto Isoelctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar

adecuadamente el buffer a utilizar o tcnicas como precipitacin
isoelctrica o cromatografa de intercambio inico.
Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las protenas,
tales como la composicin de aminocidos, la estructura tridimensional y
factores externos como pH, temperatura, fuerza inica

Estabilidad: Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son

importantes para la purificacin, en trminos de agregacin, actividad,
etc.
Polaridad: La hidrofobicidad de la protena nos permite seleccionar
tcnicas de purificacin como columnas de interaccin hidrofbicas o en
aspectos de extraccin de protenas.

Uniones especficas: Algunas protenas tienen unin a ligandos que

permiten usar tcnicas de purificacin como la cromatografa de
afinidad.
3. Precipitacin
Debido a los grupos cargados de las protenas, la solubilidad se
altera aumentando o disminuyendo cuando se modifican factores
como el pH, temperatura y fuerza inica.

Los mtodos de precipitacin son:

Precipitacin con solventes orgnicos.
Precipitacin isoelctrica
Precipitacin trmica
Precipitacin salina
La precipitacin salina de las protenas es una tcnica donde se
precipita una fraccin de protenas mediante el aumento de la
fuerza inica del medio.

Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de

protenas, disminuye la interaccin protena-H2O porque quita la
capa de solvatacin, predominando la interaccin protena-protena
y generando la precipitacin de las mismas.

La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es

igual para todas las protenas, lo que permite usar sta propiedad
para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir
de mezclas complejas.
Sin embargo el mtodo ms utilizado es la precipitacin por
salado con (NH4)2 SO4
Precipitacin con sulfato de amonio
El sulfato de amonio (NH4)2SO4 presenta una gran solubilidad (760
g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C)
y es un in divalente que alcanza altas fuerzas inicas.

La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una

mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no
desnaturalizadas.
Salting in. Es elfenmeno por el cual la concentracin de sal
aumenta la solubilidad de la protena. Al aumentar la
concentraciones se reducen las fuerzas electrostticas.
Cuando a un sistema proteico se le adicionan sales neutras en
concentraciones menores a 1.0 M, las protenas incrementan su
solubilidad.
Los cationes y aniones reaccionan con los grupos ionizables de
las protenas impidiendo las interacciones entre las cadenas
laterales oextremos terminales cargados de las protenas.

Salting out. A medida que se aumentan las concentraciones de

sales en el medio, las interacciones protena-protena se hacen
ms fuertes que las interacciones de la protena con el medio
(agua), por lo que precipitan
A concentraciones mayores a 1.0 M, las protenas tienden a
precipitar.
3. Concentracin de protenas
La concentracin es proceso mediante el cual reducimos el
volumen del solvente en el que se encuentra la protena y as
aumentar la cantidad de protena por volumen.

La concentracin de las protenas puede llevarse a cabo mediante

dos tcnicas principalmente:

Dilisis

Ultracentrifugacin
Dilisis

Tcnica que consiste en separar de una mezcla los

componentes de una disolucin, ya sea para eliminar
impurezas como sales o molculas pequeas a travs de
una membrana.
Ultracentrifugacin

Concentracin de una muestra mediante centrifugacin.

Centrifugacin diferencial

Es una tcnica en la cual se aplica la fuerza centrifuga para

separar partculas. Esta basado en el coeficiente de
sedimentacin.
Prctica:

Purificacin de la enzima Lactato

Deshidrogenasa (LDH) de msculo esqueltico
de pollo.
La lactato deshidrogenasa (LDH):

Su funcin es oxidacin de lactato a piruvato

Es una enzima que se encuentra en casi todos los tejidos.

(Hgado, corazn, vasos sanguneos, riones, bazo, pncreas,
pulmones, cerebro y msculo)
 Esta formada por 4 subunidades.
Se conocen tres tipos de subunidades: H (LDHB), M
(LDHA) y X (LDHC), que presentan pequeas diferencias en
su secuencia de aminocidos.
Su coenzima es la vitamina B.
Sus subunidades tipo H y M pueden asociarse de manera
que puede formar 5 isoenzimas.

Las diferentes isoenzimas pueden encontrarse en diferentes

tejidos :

LDH-1 (H4): Corazn, msculo, eritrocitos.

LDH-2 (H3M): Sistema retculo endotelial, leucocitos.
LDH-3 (H2M2): Pulmones.
LDH-4 (HM3): Riones, placenta y pncreas.
LDH-5 (M4): Hgado y msculo esqueltico.
Investigar:
Propiedades de la lactato deshidrogenasa de pollo (lactate
deshydrogenase from Gallus gallus isoformas A o B):

Localizacin subcelular
Secuencia primaria de aminocidos
pI (punto isoelctrico)
Nmero de residuos cargados positivamente y negativamente
Actividad enzimtica
Peso molecular
Estructura terciaria y/o cuaternaria

Ligas:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.uniprot.org/uniprot/P00340
http://www.expasy.org
http://www.uniprot.org/
http://www.brenda-enzymes.info/
Para determinar pI y nmero de residuos de
aminocidoscargados
http://web .expasy.org/compute pi/
Parte A. Extraccin.
1. Cortar en trozos pequeos 80g de pechuga de pollo (eliminar la
grasa y tejido conectivo)
2. Agregar 3 volmenes de amortiguador A fro por cada gramo de
tejido y licuar en pulsos de 3 seg./3 a 6 veces.
3. Filtrar la mezcla con gasa. Se obtiene la fraccin F0.
4. Distribuir el filtrado en botellas de centrifuga y centrifugar a 7,000
RPM a 4C durante 10 min. Recuperar el sobrenadante (F1). Almacenar
1mL a -20C.

Parte B. Precipitacin con sulfato de amonio (NH4)2SO4.

5. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlos en un vaso de precipitado.
6. Agitar en hielo el sobrenadante de manera continua y suave. Agregar
el sulfato de amonio slido (8.5 g), Agitar vigorosamente.
7. Saturacin del 55% de sulfato de amonio.
8. Centrifugar la mezcla turbia a 10,000 RPM a 4C durante 10 minutos.
9. Recolectar el sobrenadante (Fraccin 2) y registrar el volumen. Tomar
una alcuota de 1 mL y almacenar a -20C.
10. Realizar una segunda precipitacin con(NH 4)2SO4 al 75% de
saturacin. Repetir paso 6 y 7.
11. Repetir paso 8.
12. Resuspender el pellet en 1 mL de agua.
13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fraccin 3.