TRABAJO FIN DE CARRERA

CONTROL BIOLGICO DE Fusarium

oxysporum f. sp. melonis RAZA 1.2 CON
ANTAGONISTAS.

ALUMNA: RAQUEL SOBRINO RUBIO.

DIRECTORES DEL PROYECTO:

- M LUISA SORIANO MARTN

- ANDRS PORRAS PIEDRA

FECHA DE PRESENTACIN: MAYO 2005.

 IMPORTANCIA ECONMICA DEL
CULTIVO DEL MELN

PRODUCCIN EN
ESPAA DE 1 MILLN
DE TONELADAS

SUPERFICIE:
-75% CULTIVOS AL
AIRE LIBRE
-25% CULTIVOS
PROTEGIDOS

EN CLM90% EN
CIUDAD REAL
2
 INTRODUCCIN A LA FUSARIOSIS
VASCULAR DEL MELN

condiciones de desarrollo ~20 C.

primeros trabajos sobre el estado sanitario
de los melonares de Levante y Murcia en
1976.
en 1985 se describe la micosis en cultivos
bajo plstico en Almera.
3
 DIFICULTAD DE CONTROL DE LA
FUSARIOSIS VASCULAR

enfermedad muy virulenta.

reduccin de la produccin hasta un

90% .

4
 INTRODUCCIN AL CONTROL
BIOLGICO
VENTAJAS INCONVENIENTES

respetuoso con el medio ignorancia sobre su

ambiente utilizacin

no existen problemas de falta de apoyo econmico

intoxicaciones
falta de personal
no crea resistencia especializado

eliminacin casi completa enemigos naturales

de la utilizacin de susceptibles a productos
productos fitosanitarios fitosanitarios

5
 INTRODUCCIN A LOS
MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS

1. ocurre con frecuencia en la naturaleza.

2. interaccin continua entre patgenos potenciales

y sus antagonistas.
-equilibrio dinmico en la superficie del suelo-

3. microorganismos antagonistas:
- BACTERIAS: Bacillus y Pseudomonas
- HONGOS: Trichoderma y Micorrizas
Arbusculares 6
 MECANISMOS DE ACCIN DE LOS
ANTAGONISTAS
Competencia: debe existir escasez de un elemento. La
competencia ms comn es por nutrientes, oxgeno o espacio.

Interaccin directa con el patgeno:

-Parasitismo: un microorganismo parasita a otro.

- Predacin: el antagonista se alimenta de materia orgnica

entre la cual ocasionalmente se encuentra el patgeno.

Antibiosis y lisis: inhibicin del crecimiento de un

organismo por la accin de una sustancia producida por otro
organismo.

7
 OBJETIVOS
1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A
Fom MEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO

2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS

SELECCIONADOS EN EL CONTROL BIOLGICO DE
Fom RAZA 1.2 EN PLNTULAS DE MELN

3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIN DE

LAS RACES DE LAS PLNTULAS DE MELN CON
MICORRIZAS VESCULO-ARBUSCULARES EN EL
CONTROL BIOLGICO DE Fom.

8
MATERIALES
Y
MTODOS
 ANTAGONISTAS UTILIZADOS EN EL
CONTROL BIOLGICO

Trichoderma harzianum
Aspergillus A5, Aspergillus A8, Aspergillus
terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus
Penicillum sp
Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis

Fusarium oxysporum no patognicos

Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus
claroideum

10
 MATERIAL VEGETAL Y
PATGENO

SEMILLAS DE MELN DEL CULTIVAR

AMARILLO CANARIO F1 HBRIDO.

Fusarium oxysporum f. sp. melonis

RAZA 1.2 AISLADO CR 6801

11
 PRODUCCIN DE INCULO DEL
PATGENO
REPICADO DE Fom EN
PDA.
- repicado del patgeno en
placas de petri con PDA.
- estufa: 252 C, 7 das.
REPICADO DE Fom EN
CPD.
-explante en matraz
erlenmeyer.
-agitador orbital (120
rpm), 25-27C, 16 horas
luz, 6 das.
-filtrado del hongo.
-cuantificacin de la
densidad del inculo.
-ajuste de la concentracin
de inculo.
12
 CULTIVO DUAL IN VITRO

CULTIVO DUAL consiste en el enfrentamiento

del patgeno y el antagonista en una placa de
petri, analizando el crecimiento de ambos que se
compara con el crecimiento individual de cada
uno de ellos.

SEPARACIN:
- 7 cm (HONGOS)
- 5 cm (BACTERIAS)

ENSAYO: 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES

TESTIGOS DE PATGENO
TESTIGOS DE ANTAGONISTA
13
 CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2
CON Trichoderma harzianum
pequea cantidad del preparado de T.
harzianum con pinzas esterilizadas en
una placa de petri con PDA.
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom y T. harzianum.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas.
14
 CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Aspergillus A5, Aspergillus A8 y
Penicillum sp.

repicado de los hongos de la placa original

en PDA.
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom con Aspergillus y
Penicillum.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas.
15
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Aspergillus terreus, A. flavus y A.
ochraceus.
recuperacin de los hongos
liofilizados.
enfrentamiento de explantes de 5
mm de dimetro de Fom y
Aspergillus.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las
colonias cada 48 horas.
16
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Pseudomonas fluorescens y
Pseudomonas putida.

1. recuperacin de las bacterias liofilizadas.

2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO
3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom y Pseudomonas en Agar
Nutritivo (separacin de 5 cm).
4. placa de petri en estufa (27C)
5. mediciones del dimetro de las colonias cada
48 horas
17
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Bacillus subtilis.
ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE
ENSAYO EN PDA
Bacillus subtilis.

- ENFRENTAMIENTO DE - ENSAYO CON EXUDADOS DE Bacillus

EXPLANTES DE 5 mm DE
subtilis.
DIMETRO DE Fom Y Bacillus
- 5 EXPLANTES DE 5 mm.
subtilis EN PDA (SEPARACIN
- MATRAZ ERLENMEYER CON CPD.
DE 5 CM).
- AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DAS,
TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA
- PLACA DE PETRI EN ESTUFA AMBIENTE).
(27C) - COMPROBACIN DEL CRECIMIENTO.
- SE AADE AGAR.
- MEDICIONES DEL DIMETRO - EXPLANTE DE Fom.
DE LAS COLONIAS CADA 48 - COMPROBACIN DEL DIMETRO DE LA
HORAS. COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS.
18
 CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Fo NO PATOGNICO
repicado de los hongos de la placa original
en PDA
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom con Fo NO PATOGNICO.
placa de petri en estufa (27C)
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas

19
CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
PRODUCCIN DE Trichoderma
harzianum
DETERMINACIN DE LA
DENSIDAD DE INCULO DEL
PREPARADO COMERCIAL
MTODO DE LAS
DILUCIONES

- PDA CON NYSTANINA AL 1%.

- DILUCIN DEL PREPARADO
COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA.
- DILUCIONES EN 6 VIALES.
- PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27C)
- OBSERVACIN DE PLACAS CADA 12
HORAS. 21
 PRODUCCIN DE Aspergillus A5
repicado del hongo en PDA en placa de petri con
PDA (7 das,25-27C, oscuridad)

repicado del hongo en CPD

- 5 explantes de 5mm de dimetro en matraz de
CPD
- agitador orbital 120 rpm en cmara de
crecimiento (6 das, 25-27C, 16 horas de luz)

filtrado del hongo

cuantificacin de la densidad de inculo

ajuste de la concentracin de inculo

22
GERMINACIN DE SEMILLAS DE
MELN
germinacin en placas de petri
- capa de vermiculita
- disco papel secante esterilizado
- semillas
- disco de papel secante esterilizado

cmara de crecimiento (3 das, 25-

27C, 16 horas luz)

plantacin en vasos de plstico

perforados en la base o bandejas de
alvolos

Etiquetan y enumeran con el

antagonista utilizado.

cmara de crecimiento (12 das) 23

APLICACIN DE LOS ANTAGONISTAS
AL SUBSTRATO
CADA ENSAYO:

- 40 plntulas (4 repeticiones de 10 plntulas cada

una)
- 10 plntulas testigos antagonistas (control +)
- 10 plntulas testigo con inculo del patgeno
(control -)
- 10 plntulas testigo sin tratar (control )

SUBTRATO ESTRIL Y SUBTRATO NO ESTRIL

24
 SUBSTRATO
El substrato estril se utiliza para observar el
comportamiento de los microorganismos
antagonistas y Fom sin que se encuentre
sometido a la accin de otros microorganismos
que se puedan hallar en el substrato (bacterias,
hongos, etc.).

Los ensayos en substrato no estril se realizan

para observar el comportamiento de los
microorganismos antagonistas y Fom en las
condiciones en las que se encontraran las
plntulas de meln en el invernadero.

25
 TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Trichoderma harzianum
Ensayos:
a) dosis 55 gr/kg de
substrato
b) dosis 27.5 gr/kg de
substrato
Mezclar de forma
homognea
Vasos de plstico
perforados
Bandejas de alvolos
Semilla germinada de
meln
Cmara de crecimiento 26
 TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Aspergillus A5
Suspensin condica
concentracin 107
conidias/ml
En 100 ml de
substrato se aaden
10 ml de suspensin
condica
Mezcla homognea
Semilla germinada de
meln
Cmara de
crecimiento

27
 TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
MICORRIZAS
En 150 ml de
substrato se aade
una cucharilla de
caf rasa del
preparado
micorrzico
Semilla de meln
germinada
Cmara de
crecimiento
28
INOCULACIN DE LAS PLNTULAS DE
MELN CON EL PATGENO

Suspensin de 5 x 105 conidias/ml de

Fom Raza 1.2

Se aaden 10 ml de suspensin a
cada vaso que contiene las plntulas
de meln.

Cmara de crecimiento
29
 REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA.
REAISLAMIENTO
siembra en PDA de
fragmentos de raz,
cuello y tallo
(desinfestados) para
comprobar si el
patgeno ha sido
capaz de colonizar el
sistema vascular de
las plantas tratadas
con antagonistas e
inoculadas con Fom
30
 CLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON
MICORRIZAS ARBUSCULARES.
Con el microscopio se realizan
observaciones verticales en el
porta-objetos tomando como
referencia una distancia
constante de 0.2 mm, y se
anotan en 100 intersecciones si
estn o no micorrizadas.
A los 30 das del tratamiento.
3 plantas por ensayo
Lavado de races
Fragmentos de 2-3 cm
Decoloracin de races con KOH al
10%, temperatura ambiente
Lavado y acidificacin con CLH
0.1N durante 30 minutos.
Tincin con Azul Tripn (4 horas)
Intervalos de 15 min, lavado con
agua
Colocacin de fragmentos en un
porta-objetos de forma paralela 31
 EVALUACIN DE LA INCIDENCIA Y
SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD
ESCALA DE SEVERIDAD

0 0% PLANTA SANA

1 0-10% SNTOMAS LEVES

2 10-50% SNTOMAS
SEVEROS

3 50-75% SNTOMAS MUY

SEVEROS

4 >75% PLANTA MUERTA 32

RESULTADOS
 1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO

Finalizacin del ensayo:

- Unin fsica entre las colonias de

antagonista y patgeno
- Halo de separacin constante
durante varias mediciones
34
RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO

Halo de inhibicin entre el patgeno y

Aspergillus A5
35
DETERMINACIN DE LA DENSIDAD DE
INCULO DEL PREPARADO COMERCIAL
DE Trichoderma harzianum
conteo a las 48 horas de
realizarse las diluciones
- incontables
- placas dilucin -6
contables

resultado total 16.6 x 107

u.f.c en el paquete original
de Trichoderma harzianum
36
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma
harzianum dosis 55 g/kg substrato
estril.
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
55 g/Kg substrato no estril.
37
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma harzianum
dosis 55 g/kg substrato estril
(transplante).
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/kg substrato estril.
38
 RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores medios
del ensayo utilizando como antagonista
Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg
substrato no estril.
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/Kg substrato estril, transplante.
39
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Aspergillus A-5.
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Glomus mosseae.
40
 RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

Curva de progreso de la enfermedad tras Curva de progreso de la enfermedad tras

infectar las plantas con el patgeno (testigo infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como medios del ensayo utilizando como antagonista

antagonista Glomus intraradices Glomus claroideum.

41
 RESULTADO DEL REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA

Reaislamiento del patgeno de planta tratada

con Trichoderma harzianum utilizando la Reaislamiento del patgeno en PDA de
plantas tratadas con Glomus intraradices
dosis recomendada (substrato no estril)

En todas las pruebas de aislamiento se dio positivo

en cuanto a infestacin de las plantas por Fusarium
oxysporum f. sp. Melonis.

42
REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA

Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes

de plantas tratadas con distintas dosis de
Trichoderma harzianum, en substrato estril (SE)
y no estril (SNE), procedentes de explantes de
raz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio
(TM) y tallo alto (TA).

43
 REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA

Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de

plantas tratadas con Micorrizas Arbusculares, en sustrato
estril (SE), procedentes de explantes de raz (R), cuello
(C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).

44
 3. RESULTADO DEL CLCULO DEL PORCENTAJE
Los porcentajes de raz
DE MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
micorrizada obtenidos
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON M.A.
son los siguientes:

- Glomus intraradices:
1012 %
- Glomus mosseae:
1041 %
- Glomus claroideum: Resultado del clculo del porcentaje
de micorrizacin de las races de las
1023 % plntulas de meln tratadas con
micorrizas.

45
RESULTADO DEL CLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON M.A.

Observacin de la micorriza por el microscopio,

donde se aprecian vesculas dentro de la raz.

46
4. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

Comparativa de las diferentes curvas de progreso de la

enfermedad de los ensayos realizados 47
 DISCUSIN DE LOS RESULTADOS
En los diferentes ensayos realizados, se ha podido
observar que las plntulas de meln tratadas con
Trichoderma harzianum (55 gr/kg substrato
estril) y Glomus claroideum, han conseguido
retardar el proceso de infeccin del patgeno Fom
raza 1.2 en 8 das, siendo la media de los dems
ensayos de 5,8 das.

Se ha comprobado de igual forma que tras el

reaislamiento del patgeno en PDA en todos los
ensayos realizados, ste se ha desplazado de
forma sistmica por toda la plntula produciendo
la muerte.
48
 5. RESULTADO DEL ANLISIS
ESTADSTICO
ANOVA Table: En los ensayos realizados no
hubo diferencias significativas entre las
variables, con un 95% de nivel de
confianza.

MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos

realizados no hubo diferencias
significativas entre los pares de datos, con
un 95% de nivel de confianza.

49
 CONCLUSIONES
Los microorganismos que han resultado demostrar
su eficacia antagonista ante el patgeno Fusarium
oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en el control
biolgico in vitro tras realizarse los experimentos
han sido: Trichoderma harzianum y Aspergillus A-5.

En los ensayos realizados, se ha comprobado que la

inoculacin con Trichoderma harzianum
(empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg)
estimul el crecimiento de las plntulas de meln.

50
 CONCLUSIONES
Ningn hongo o bacteria que se ha utilizado en
este proyecto ha dado como resultado un control
total de Fusarium oxysporum f. sp. melonis, si
bien se ha demostrado que los hongos
Trichoderma harzianum (dosis 55 gr/Kg de
substrato estril) y Glomus claroideum ha
retardado la aparicin de los sntomas del hongo
patgeno sobre las plntulas que se han tratado.

Los porcentajes de micorrizacin de las races de

las plntulas de meln tratadas con Micorrizas
Arbusculares (MA) han sido bajos, alrededor de
un 10 %, debido a esto su eficacia como
microorganismo antagonista no ha sido efectivo
51
 FINAL
PRESENTACIN