Medios de Cultivo

Medios de Cultivo
y
Pruebas Bioqumicas
INTRODUCCIN
Uno de los sistemas ms importantes para

la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y
el crecimiento de los microorganismos es
el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a
la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse
a 40 grados.
Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.
Cultivo de las Microorganismos
.
Clasificacin de los medios de cultivo.
Se clasifican por su consistencia:

Slidos
Semislidos
Lquidos
Clasificacion
Por su finalidad.
Medio de transporte.
Medio de enriquecimiento.
Comn.
Selectivo.
Diferencial.
Aislamiento de los M.O.
Proceso o mtodos que deben

aplicarse para conseguir el desarrollo
de colonias de bacterias aisladas para
estudiar sus caractersticas.
Las colonias bacterianas son masas
visibles de clulas que se forman por
la divisin binaria.
Estudio macroscpico de colonias
Estudio macroscpico de colonias
Pigmentos
El color de las colonias en algunos casos
depende de la presencia de pigmentos
Hemlisis
Ocasionada por una toxina llamada

Hemolisina, lisa los globulos rojos, se
visualiza in vitro en medios de cultivo
que contienen sangre.
Caractersticas de los cultivos en medios lquidos
Turbidez.
Formacin de pelcula.
Formacin de precipitado o sedimento.

Medios
de
Cultivo
Medios de Cultivo
Clasificacin de los medios de cultivo basndose en su composicin
qumica
A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de

carbono, fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe,
Ca),
Otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para
Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B.- Medios complejos Estos medios llevan ingredientes como extracto

de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que
contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la
composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con
aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes).
Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento
especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin
microbiana mixta.
Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando

cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como
nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la
discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades
diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey

diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte
rpida de las clulas.
Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen

cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa
en los medios de mantenimiento.
Agar-Agar
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos
nutritivos.
Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de

alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
destilada. Mezclar y dejar reposar 5
Extracto de carne 3.0
minutos. Calentar suavemente agitando y
Cloruro de sodio 8.0 hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin.
Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
Agar 15.0 minutos.
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de

microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales. No contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano.
La pluripeptona es la fuente de carbono y

nitrgeno para el desarrollo bacteriano.
El agregado de cloruro de sodio permite el

enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de
microorganismos exigentes.
Caractersticas del medio: mbar claro

a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris
Base Agar Gelosa Sangre
Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.

Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de
microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una
gran variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.
Frmula (en gramos por litro)
Infusin de msculo de corazn 375.0

Peptona 10.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
La infusin de msculo de corazn y la

peptona, otorgan al medio un alto valor
nutritivo, que permite el crecimiento de
una gran variedad de microorganismos,
an de aquellos nutricionalmente
exigentes.
El cloruro de sodio mantiene el balance

osmtico.
El agregado de sangre al medio de

cultivo, en concentracin final de 5-10
%, aporta nutrientes para el crecimiento
bacteriano, y permite detectar Caractersticas del medio
hemlisis. Medio preparado: mbar.
Medio preparado con 5% de sangre

de carnero: rojo cereza.
E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Peptona 10.0
Suspender 36 g del polvo en un litro
Lactosa 5.0 de agua destilada. Reposar 5 minutos;
Sacarosa 5.0 mezclar, calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos hasta su
Fosfato dipotsico 2.0
disolucin. Esterilizar en autoclave a
Agar 13.5 no ms de 121 C durante 15 minutos.
Eosina 0.4 Enfriar a 45 C y distribuir agitando
suavemente.
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 0.2
Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos.
La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y

aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico

brillo metlico.
Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes
Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

transparentes,
La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

C. albicans
Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las
cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello
se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de

Salmonella y Shigella.
Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Escherichia coli Verdosas con brillo metlico y centro negro

azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa prpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras
Caractersticas del medio

Mac Conkey Agar
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil

desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias
que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas
las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0
Lactosa 10.0 Suspender 50 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar
Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en autoclave
Agar 13.5
a 121 C durante 15 minutos.
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en
las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Resultados
Microorganismos Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes
Shigella flexneri Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas
Medio preparado: rojo prpura
Estafilococo 110 Agar
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin presuntiva de

estafilococos, en base a la produccinde pigmentos, la fermentacin de
manitol y la hidrlisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.

Extracto de levadura 2.5
Triptena 10.0 Suspender 149 g del medio en un
Gelatina 30.0 litro de agua destilada. Reposar 5
minutos y mezclar calentando a
Lactosa 2.0 ebullicin durante 1 o 2 minutos.
D-Manitol 10.0 Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121 C. Verter en placas y
Cloruro de sodio 75.0 mezclar para dispersar el
Fosfato dipotsico 5.0 precipitado.
Agar 15.0
pH final: 7.0 0.2
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin
alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos
selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio
110.
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los

nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de
la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono
fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para
inhibir el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp.,
logrndose as un medio selectivo para el desarrollo de estos
microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente,
es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificacin
presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentacin de
manitol e hidrlisis de la gelatina.
Resultados
Observar las caractersticas de las colonias y realizar las pruebas de
identificacin de microorganismos.
1-Fermentacin de manitol: agregar unas gotas de prpura de

bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y
en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el
color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de

crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos
permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento

bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrlisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solucin saturada de sulfato de
amonio y colocar en estufa, a 35-37 C, en aerobios durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Resultados
Microorganismo Pigmento Fermentacin de Hidrlisis de Prueba de la

manitol la gelatina coagulasa
S. aureus + + + +
S. aureus + + + +
S. epidermidis - - + -

Medio preparado: mbar claro, opalescente con precipitado.
Sal y Manitol Agar
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y
diferenciacin de estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir

de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales
de importancia sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas

de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio
Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por litro de
d-Manitol 10.0 mezclar calentando a ebullicin
Cloruro de sodio 75.0 durante 1 o 2 minutos. Distribuir y
esterilizar en autoclave a 118-121 C
Agar 15.0 durante 15 minutos.
Rojo de fenol 0.025
pH final: 7.4 0.2
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;

las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una

zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso
de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente

de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol
es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y
fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no
fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan

como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias

rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Resultados
Microorganismos Crecimiento Caractersticas de las colonias
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla
Staphylococcus epidermidis ATCC Bueno Roja
14990
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

Medio preparado: rojo
Salmonella Shigella Agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

Pluripeptona 5.0
Lactosa 10.0
Suspender 60 g del polvo por litro de
Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar.
Citrato de sodio 8.5 Calentar a ebullicin durante 2 o 3
minutos. NO ESTERILIZAR EN
Tiosulfato de sodio 8.5 AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y
Citrato frrico 1.0 distribuir unos 20 ml por placa.
Secar la superficie del medio unos
Agar 13.5
minutos en la estufa.
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 0.2
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.
La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido

sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,

acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,

crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Resultados
Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis Transparentes, centro negro
Escherichia coli Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas
Enterococcus faecalis Incoloras, de muy escaso
crecimiento

Medio preparado: rojo naranja.
A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac +
C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2S
E: Pseudomona aeruginosa
Mueller Hinton Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de

sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre
para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Infusin de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado
Peptona cida de casena 17.5 en un litro de agua destilada. Dejar
embeber de 10 a 15 minutos. Calentar
Almidn 1.5 con agitacin frecuente y hervir durante
1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15
minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a
cajas de Petri (o agregar los
Agar 15.0 suplementos que se desee) hasta un
nivel de 4 mm sobre una superficie
horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm
de dimetro).
pH final: 7.3 0.1
Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomend su uso en
forma rutinaria para la realizacin del antibiograma en medio slido, debido
a una serie de factores :
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,
su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es

bajo,
la mayora de los patgenos crece satisfactoriamente
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Resultados
Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la
metodologa apropiada.
Medio preparado: mbar.
Chromobacterium violaceum Pseudomona aeruginosa Streptococcus pyogenes

Cerebro Corazn Infusin
Medio lquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias
aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,
neumococos y otros microorganismos de difcil desarrollo.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amikacina, se utiliza

este medio para el cultivo de hongos patgenos.

Infusin de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro de
Infusin corazn vacuno 250.0
agua destilada. Calentar a ebullicin
hasta disolver completamente.
Peptona 10.0 Esterilizar en autoclave a 121 C durante
Cloruro de sodio 5.0 15 minutos. Los tubos que no se usen
inmediatamente debern calentarse en
Glucosa 2.0 un bao hirviendo para la eliminacin
del oxgeno retenido. Enfriar
Fosfato disdico 2.5
rpidamente sin agitar.
pH final: 7.4 0.2
Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo
microbiano. La infusin de cerebro de ternera, la infusin de corazn vacuno y
la peptona, son la fuente de carbono, nitrgeno, y vitaminas.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene

el balance osmtico y el fosfato disdico otorga capacidad buffer.
Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya
que en esta infusin desarrollan todas las especies de estreptococos excepto
los tiol y piridoxal dependientes.
Los estafilococos que crecen en esta infusin suelen dar mejores reacciones
en la prueba de la coagulasa.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amicacina, se inhibe la

flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos
patgenos.
Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea
necesario, subcultivar en medios slidos apropiados y realizar la identificacin
bioqumica.
Microorganismos Crecimiento
Neisseria meningitidis Bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae Bueno a excelente
Streptococcus pyogenes Bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae Bueno a excelente
Medio preparado: mbar claro, sin precipitado.
uninoculated
: tube
Neisseria
: meningitidis
Strepcococcus
: pyogenes
Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella
spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.

Peptona 5.0
Suspender 46 g del polvo en 1 litro de
Sales biliares 1.0 agua destilada. Mezclar vigorosamente y
Carbonato de calcio 10.0 llevar a ebullicin. Enfriar a 45 C o
menos. Agregar 20 ml de solucin
Tiosulfato de sodio 30.0
iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por
pH final: 8.4 0.2 tubo, en tubos estriles. No debe
Solucin iodo iodurada
calentarse luego de agregar la solucin
iodada. El medio base puede mantenerse
Iodo 6.0 a 4 C , dura varios meses, pero una vez
Ioduro de potasio 5.0 agregada la solucin iodada debe usarse
en el mismo da.
Agua 20.0
Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe
metabolitos txicos.
La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato

(generado en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales
biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la
flora acompaante.
Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar

40 mg/l de Novobiocina, antes de la solucin iodada
Resultados
Microorganismos Crecimiento
Salmonella typhi Escaso
Salmonella typhimurium Bueno-excelente
Salmonella enteritidis Bueno-excelente
Escherichia coli Escaso

Medio preparado: suspensin blanco lechosa.
Stuart Medio de Transporte
Medio destinado a la recoleccin, transporte y preservacin de muestras

clnicas aptas para exmenes bacteriolgicos. Es til para mantener la
viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difcil desarrollo.

Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro de
Glicerofosfato de sodio 10.0
agua destilada. Reposar 5 minutos.
Calentar a ebullicin hasta disolucin
Cloruro de calcio 0.1 total. Distribuir en tubos con cierre a
Azul de metileno 0.002 rosca (para evitar oxidacin)
llenndolos hasta 2/3 del tubo.
Agar 3.0 Esterilizar 15 minutos a 121C.
Dejar solidificar en posicin vertical.
pH final: 7.4 0.2
Fundamento
Medio semislido, no nutritivo.
Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til

para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de
metileno, que es el indicador de oxido reduccin.
De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su

envo al laboratorio. Cooper encontr que usando hisopos impregnados con
carbn bacteriolgico se recuperan en forma exitosa numerosos patgenos
entricos y respiratorios.
Resultados
Los tubos con medio de transporte

se subcultivan en medios slidos
apropiados segn la muestra y el
microorganismo que se quiera
aislar. Luego de la incubacin, debe
haber escasa o nula reduccin de la
viabilidad de los microorganismos.

Medio preparado: ligeramente
opalescente con tonalidad azul
dependiendo del grado de
oxidacin.
Pruebas
Bioqumicas
INTRODUCCIN
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de

manera detallada su actividad bioqumica, porque otras caractersticas no
son suficientemente distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la
caracterizacin bioqumica de una especie.
Adems de los productos finales de los procesos metablicos, tambin

se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como
ocurren paso a paso las reacciones qumicas, cules enzimas
intervienen, cuales son los productos intermediarios adems de que se
deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioqumicas que
tienen lugar dentro de la clula.
En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una

sustancia nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del
cultivo se examina para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido.
Enterotube II
Kligler Hierro Agar
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos

para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin
de glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico.

Peptona de carne 13.0
Cloruro de sodio 5.0
Suspender 54.8 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar
Tripteina 10.0 con agitacin frecuente, hervir 1 o 2
Glucosa minutos hasta disolucin total. Llenar
1.0
hasta la tercera parte de los tubos de
Citrato de hierro y amonio 0.5 ensayo. Esterilizar a 121 C por 15
Tiosulfato de sodio 0.3 minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los

nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de

cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro
de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el

balance osmtico. El agar es el agente solidificante.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo

solamente fermenta la glucosa.
2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo

fermenta glucosa, y lactosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no

fermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el

microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido

sulfhdrico.
Caractersticas del
medio

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en

base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de
cido sulfhdrico.

Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro
Lactosa 10.0 de agua destilada. Mezclar bien y
calentar con agitacin frecuente,
Sacarosa 10.0 hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin
Glucosa 1.0 total. Llenar hasta la tercera parte de
los tubos de ensayo. Esterilizar a
Sulfato de hierro y amonio 0.2 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico
Tiosulfato de sodio 0.2 de flauta profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,

aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono

fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de

cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene

el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan

por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
Lisina Hierro Agar
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente

Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desanimacin de la lisina y
en la produccin de cido sulfhdrico.

Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio
Extracto de levadura 3.0 deshidratado en un litro de agua
Glucosa 1.0 destilada. Dejar embeber unos 15
minutos. Calentar cuidadosamente,
Lisina 10.0 agitando con frecuencia y hervir
Citrato de hierro y amonio 0.5 durante un minuto hasta la disolucin
completa. Distribuir y esterilizar a
Tiosulfato de sodio 0.04 121 C durante 15 minutos. Enfriar en
Prpura de bromocresol 0.02 pico de flauta dejando un fondo
vertical apto para la puncin.
Agar 15.0
pH final: 6.7 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los

nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la

produccin de cido sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a

pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza
el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es

necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del
medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de
Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el
cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo
en la superficie del medio.
Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero
Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el
lmite del pico y fondo)

Medio preparado: color violeta.
Color en el pico de flauta Ennegrecimiento
Microorganismos Color en la base del tubo
del medio
Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo
Salmonella typhimurium Prpura Prpura Positivo
Salmonella enteritidis Prpura Prpura Positivo
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Prpura Amarillo Positivo
Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Prpura Prpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Prpura Prpura Negativo
Escherichia coli Prpura Prpura Negativo
MIO Medio
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,

actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Dextrosa 1.0
Extracto de levadura 3.0
Suspender 31 g del polvo en un
Peptona 10.0 litro de agua destilada. Calentar
Triptena 10.0 a ebullicin hasta completa
Clorhidrato de L-ornitina 5.0 disolucin. Distribuir en tubos y
esterilizar 15 minutos a 121 C.
Agar 2.0
Prpura de bromocresol 0.02
pH final: 6.5 0.2
Fundamento
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de

extracto de levadura, peptona y triptena.
Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la

enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato

para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura
y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:

movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento
que difunde mas all de la lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la

enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.
Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del

indicador hacia el color prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que

contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de
agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado
positivo.
Resultados
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la
lnea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color prpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color
violceo en la superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y
la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-
amarillento.

Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.
SIM Medio
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol

y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros
de la familia Enterobacteriaceae.
Triptena 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua

Peptona 6.1 destilada. Mezclar hasta disolver; calentar
agitando y hervir durante un minuto. Distribuir
Sulfato de hierro y amonio 0.2
unos 4 ml en tubos de hemlisis y esterilizar
Tiosulfato de sodio 0.2 en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Agar 3.5 Solidificar en posicin vertical.
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y

particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.
El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de

Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado
negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas
all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea

de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de

siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el

reactivo de Kovac s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Medio preparado: mbar.
Urea
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad uresica.

Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Urea 20.0
Suspender 3, 87 g del medio
Fosfato monopotsico 9.1 deshidratado por cada 100 ml de
Fosfato disdico agua destilada. Disolver sin calentar
9.5
y esterilizar por filtracin. Distribuir
Extracto de levadura 0.1 en tubos pequeos estriles, entre
0,5 y 2 ml.
Rojo fenol 0.01
pH final: 6.8 0.2

Fundamento
Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo

contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.
El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y

cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el
indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno

proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de
carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el
indicador rojo fenol del amarillo al rojo.
Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros.
Medio preparado: anaranjado.
Urea-
1 Uninoculated Control,
2 Proteus Vulgaris,
3 E. coli
Simmons Citrato Agar
Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de agua destilada.
Fosfato dipotsico 1.0
Dejar reposar 5 minutos y mezclar
Fosfato monoamnico 1.0 calentando a ebullicin durante 1 o 2
Sulfato de magnesio 0.2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar
en autoclave a 121 C durante 15
Azul de bromotimol 0.08 minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y

el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimtico.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de

utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica
fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento
del citratoda progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatosy bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin
de citrato permeasa.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo Citrato permeasa Color del medio
Klebsiella pneumoniae Positivo Azul

S. typhimurium Positivo Azul
E. coli Negativo Verde
S. flexneri Negativo Verde

Medio preparado: verde.
Gracias!

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Medios de Cultivo

Uno de los sistemas ms importantes para

El material alimenticio en el que crecen los

Se clasifican por su consistencia:

Proceso o mtodos que deben

Ocasionada por una toxina llamada

Formacin de precipitado o sedimento.

A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de

B.- Medios complejos Estos medios llevan ingredientes como extracto

Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen

Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Es un medio usado para el cultivo de

La pluripeptona es la fuente de carbono y

El agregado de cloruro de sodio permite el

Caractersticas del medio: mbar claro

Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.

Frmula (en gramos por litro)

Infusin de msculo de corazn 375.0

La infusin de msculo de corazn y la

El cloruro de sodio mantiene el balance

El agregado de sangre al medio de

Medio preparado con 5% de sangre

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de

Escherichia coli Verdosas con brillo metlico y centro negro

Caractersticas del medio

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin presuntiva de

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los

1-Fermentacin de manitol: agregar unas gotas de prpura de

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Microorganismo Pigmento Fermentacin de Hidrlisis de Prueba de la

Caractersticas del medio

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir

Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;

Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias

Caractersticas del medio

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,

Caractersticas del medio

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones