34.1 Introduction (SB p.

77)

Introduction
The determination of the structure of an
organic compound involves:
1. Isolation and purification of the compound
2. Qualitative analysis of the elements
present in the compound
3. Determination of the molecular formula of
the compound
4. Determination of the functional group
present in the compound
1 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.1 Introduction (SB p.77)

Introduction

The general steps to determine the structure

of an organic compound

Check Point 34-

2 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
1
 34.2
Isolation and
Purification of
Organic
Compounds
3 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Isolation and Purification of

Organic Compounds
These techniques include:
1. Filtration
2. Centrifugation
3. Crystallization
4. Solvent extraction
5. Distillation

4 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Isolation and Purification of

Organic Compounds
These techniques include:
5. Fractional distillation
6. Sublimation
7. Chromatography

5 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Isolation and Purification of

Organic Compounds
The selection of a proper technique
depends on the particular differences
in physical properties of the
substances present in the mixture

6 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Filtration
To separate an insoluble solid from a
liquid particularly when the solid is
suspended throughout the liquid
The solid/liquid mixture is called a
suspension

7 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Filtration

The laboratory set-up of filtration

8 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.78)

Filtration
There are many small holes in the filter
paper
allow very small particles of solvent
and dissolved solutes to pass through
as filtrate
Larger insoluble particles are retained on
the filter paper as residue

9 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

Centrifugation
When there is only a small amount of
suspension, or when much faster
separation is required
Centrifugation is often used
instead of filtration

10 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

Centrifugation
The liquid containing
undissolved solids is put
in a centrifuge tube
The tubes are then put
into the tube holders in a
centrifuge

A centrifuge
11 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

Centrifugation
The holders and tubes are spun around at a
very high rate and are thrown outwards
The denser solid is collected as a lump at
the bottom of the tube with the clear liquid
above

12 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

Crystallization

Crystals are solids that have

a definite regular shape
smooth flat faces and straight edges
Crystallization is the process of forming
crystals

13 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

1. Crystallization by Cooling a Hot Concentrated

Solution
To obtain crystals from an unsaturated
aqueous solution
the solution is gently heated to make it
more concentrated
After, the solution is allowed to cool at
room conditions

14 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

1. Crystallization by Cooling a Hot Concentrated

Solution
The solubilities of most solids increase
with temperature
When a hot concentrated solution is
cooled
the solution cannot hold all of the
dissolved solutes
The excess solute separates out as
crystals
15 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.79)

1. Crystallization by Cooling a Hot Concentrated

Solution

Crystallization by cooling a hot concentrated solution

16 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

2. Crystallization by Evaporating a Cold Solution

at Room Temperature
As the solvent in a solution evaporates,
the remaining solution becomes more
and more concentrated
eventually the solution becomes
saturated
further evaporation causes
crystallization to occur

17 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

2. Crystallization by Evaporating a Cold Solution

at Room Temperature

If a solution is allowed to stand at room

temperature,
evaporation will be slow
It may take days or even weeks for crystals
to form

18 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

2. Crystallization by Evaporating a Cold Solution

at Room Temperature

Crystallization by slow evaporation of a solution

(preferably saturated) at room temperature

19 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

Solvent Extraction
Involves extracting a component from a
mixture with a suitable solvent
Water is the solvent used to extract salts
from a mixture containing salts and sand
Non-aqueous solvents (e.g. 1,1,1-
trichloroethane and diethyl ether) can be
used to extract organic products

20 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

Solvent Extraction
Often involves the use of a separating
funnel
When an aqueous solution containing
the organic product is shaken with
diethyl ether in a separating funnel,
the organic product dissolves into
the ether layer

21 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

Solvent Extraction

The organic product in an aqueous solution can be

extracted by solvent extraction using diethyl ether
22 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

Solvent Extraction
The ether layer can be run off from the
separating funnel and saved
Another fresh portion of ether is shaken
with the aqueous solution to extract any
organic products remaining
Repeated extraction will extract most of
the organic product into the several
portions of ether

23 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.80)

Solvent Extraction
Conducting the extraction with several
small portions of ether is more efficient
than extracting in a single batch with the
whole volume of ether
These several ether portions are
combined and dried
the ether is distilled off
leaving behind the organic product

24 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.81)

Distillation
A method used to separate a solvent
from a solution containing non-volatile
solutes
When a solution is boiled,
only the solvent vaporizes
the hot vapour formed condenses to
liquid again on a cold surface
The liquid collected is the distillate
25 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.81)

Distillation

The laboratory set-up of distillation

26 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.81)

Distillation
Before the solution is heated,
several pieces of anti-bumping
granules are added into the flask
prevent vigorous movement of the
liquid called bumping to occur during
heating
make boiling smooth

27 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.81)

Distillation

If bumping occurs during distillation,

some solution (not yet vaporized)
may spurt out into the collecting
vessel

28 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.81)

Fractional Distillation
A method used to separate a mixture of
two or more miscible liquids

29 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Fractional Distillation

The laboratory set-up of

fractional distillation
30 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Fractional Distillation
A fractionating column is attached vertically
between the flask and the condenser
a column packed with glass beads
provide a large surface area for the
repeated condensation and vaporization
of the mixture to occur

31 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Fractional Distillation
The temperature of the escaping vapour
is measured using a thermometer
When the temperature reading becomes
steady,
the vapour with the lowest boiling
point firstly comes out from the top of the
column

32 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Fractional Distillation
When all of that liquid has distilled off,
the temperature reading rises and
becomes steady later on
another liquid with a higher boiling point
distils out
Fractions with different boiling points can
be collected separately

33 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Sublimation
Sublimation is the direct change of
a solid to vapour on heating, or
a vapour to solid on cooling
without going through the liquid
state

34 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.82)

Sublimation
A mixture of two compounds is heated in an
evaporating dish
One compound changes from solid to
vapour directly
The vapour changes back to solid on a
cold surface
The other compound is not affected by
heating and remains in the evaporating dish

35 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Sublimation

A mixture of two compounds can be

separated by sublimation
36 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography

An effective method of separating a

complex mixture of substances
Paper chromatography is a common
type of chromatography

37 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography

The laboratory set-up of paper chromatography

38 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography
A solution of the mixture is dropped at
one end of the filter paper

39 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography
The thin film of water adhered onto the surface
of the filter paper forms the stationary phase
The solvent is called the mobile phase or eluent

40 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography
When the solvent moves across the sample spot
of the mixture,
partition of the components between the
stationary phase and the mobile phase occurs

41 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.83)

Chromatography
As the various components are being
adsorbed or partitioned at different rates,
they move upwards at different rates
The ratio of the distance travelled by the
substance to the distance travelled by the
solvent
known as the Rf value
a characteristic of the substance
42 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Thin Layer Chromatography

43 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Thin Layer Chromatography

44 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Thin Layer Chromatography

45 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Thin Layer Chromatograph

46 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Chromatographic Columns

47 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Flash chromatography
Traditional column chromatography (LC) typically takes many hours. Flash
chromatography allows separations of samples weighing 0.01-10.0 g in less than 15
min elution time6 and produces separation similar to those obtained from TLC. In
flash chromatography, the column is pressurized with a flow control adaptor attached
to the top of the column to pressure the column (Figure 4.42). The flow control
adaptor is attached to an air line at a medium pressure. The stopcock on this adaptor is
adjusted so that the air flow is not too strong.
Solvent System A low-viscosity solvent system must be used for flash
chromatography. The chosen solvent system should produce an Rf value centered
around 0.35 on the TLC for the components to be effectively separated.
Column Construction After selection of a column of the correct size (Table 4.7), it is
packed using either the slurry method (pp. 101-103) or the dry column method (pp.
103-106). The amount of silica gel used should be approximately 50 times the weight of the
48mixture to be separated. New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
49 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.84)
A summary of different techniques of
isolation and purification
Technique Aim
(a) Filtration To separate an insoluble solid from a
liquid (slow)
(b) Centrifugation To separate an insoluble solid from a
liquid (fast)
(c) Crystallization To separate a dissolved solute from
its solution
(d) Solvent To separate a component from a
extraction mixture with a suitable solvent
(e) Distillation To separate a liquid from a solution
containing non-volatile solutes
50 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 34.2 Isolation and Purification of Organic Compounds (SB p.84)

A summary of different techniques of

isolation and purification
Technique Aim
(f) Fractional To separate miscible liquids with
distillation widely different boiling points
(g) Sublimation To separate a mixture of solids in
which only one can sublime
(h) To separate a complex mixture of
Chromatography substances

Check Point 34-

2
51 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Kromatografi gas
Analisis kimia untuk
pemisahandan analisis
senyawa yang
dapatmenguaptanpa
mengalamidekomposisi.
Fasagerak berupa gas
pembawa, biasanya
gasinert(tidak reaktif)
sepertiheliumatau gas
sepertinitrogen.
Fasa diamberupa lapisancairan
mikroskopik ataupolimerdi
ataspadatanpendukung fasa
diam, yang berada di dalam
tabungkacaatau logamyang
disebut
52 kolom.
New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Senyawa dalam fasa gas yang dianalisa
berinteraksi dengan dinding kolom, yang dilapisi
dengan fasa diam. Hal ini menyebabkan masing-
masing senyawa mengalamielusi pada waktu
yang berbeda, dan ini dikenal sebagaiwaktu
retensisenyawa. Perbandingan waktu retensi
merupakan keluaran dari KG yang dapat
dianalisis.

53 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

Fungsi fasa diam di dalam
kolom untuk memisahkan
komponen yang berbeda,
mengakibatkan masing-
masing keluar dari kolom
pada saat yang berbeda
(waktu retensi).
Parameter lain yang dapat
digunakan untuk mengubah urutan
atau waktu retensi adalah laju
aliran gas pembawa, panjang
kolom dan temperatur.

Saat gas pembawa membawa

molekul analit melalui kolom,
pergerakan ini dihambat
olehadsorbs molekulanalit pada
dinding kolom atau bahan yang
terikat dalam kolom.

54 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

55 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
56 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Auto sampler
Insersi manual sampel saat ini tidak lagi
umum, ununnya menggunakan aoutosampler.
Autosampler menyediakan cara yang efektif
untuk memasukkan sampel secara otomatis
ke dalam inlet.
Insersi otomatis menghasilkan
reprodusibilitas dan optimasi waktu yang
lebih baik.
Terdapat berbagai jenis autosampler.
Autosampler dapat dikelompokkan dalam
hubungannya dengan kapasitas sampel (auto-
injektor vs autosampler), teknologi robotik
(XYZ robot vs. rotating robot yang paling
umum), atau analisisnya.
- Cairan
- Head-spacestatis olehsyringe technology
-Head-spacedinamis olehtransfer-line
technology
Ekstraksi mikro fasa padat(En:Solid phase
microextraction, SPME)

57 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

Inlet:
Inlet kolom (atau injektor) berfungsi untuk mengintroduksi sampel ke dalam aliran kontinu gas
pembawa. Inlet adalah perangkat keras yang melekat pada pangkal kolom.

Jenis-jenis inlet yang umum adalah:

-Injektor S/SL (split/splitless). Sampel dimasukkan ke dalam bejana kecil yang dipanaskan
menggunakansyringemelalui septum, sampel berkonsentrasi analit tinggi (>0,1%).
-Inleton-column; di sini, sampel diintroduksi seluruhnya langsung ke dalam kolom, baik dalam
kondisi tanpa pemanasan atau di bawah titik didih pelarut.
- Injektor PTV; sampel suhu terprogram, teknik ini sebagai metode untuk mengintroduksi sampel
dalam volume besar (s/d 250 L) dalam kapiler KG

58 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Detektor
Detektor yang paling banyak digunakan adalah:
- detektor ionisasi nyala(En:Flame Ionisation Detector, FID) dan
- detector konduktivitas termal (En:Thermal Conductivity Detector, TCD).

- Keduanya sensitif untuk hampir semua komponen, dan keduanya bekerja pada
rentang konsentrasi yang lebar.
- Sementara TCD adalah detektor universal dan dapat digunakan untuk
mendeteksi komponen apapun selain gas pembawa (selama konduktivitas
termalnya berbeda dari gas pembawa pada temperatur detektor)
- FID peka terutama untuk hidrokarbon, dan kepekaannya melebihi TCD pada
hidrokarbon. Meski demikian, FID tidak dapat mendeteksi air.
- Kedua detektor termasuk cukup tegar. Oleh karena TCD bersifat non-destruktif,
TCD dapat dipasang secara serial sebelum FID (destruktif), sehingga
menghasilkan deteksi yang komplementer untuk analit yang sama.

59 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Rekorder
Hasil analisis dari detector akan diinterpretasi dalam rekorder yang berupa
kromatogram.
Saat ini umumnya dihungkan dengan computer dengan menggunakan program
tertentu.

60 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

https://www.youtube.com/watch?v=ZpPzImDSfqc

https://www.youtube.com/watch?v=ZpPzImDSfqc

61 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 HPLC (high performance chromatography)

Pengertian HPLC
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan
tinggi.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat
padat tertentu.
Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam
(stasioner).
Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap
senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu.
Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram
memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

62 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 JENIS-JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan:

fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding
dengan fase geraknya).
fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan
ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik.

63 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai
berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan lapis
tipis
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam
yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang
paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.

64 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi
masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang
mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan
atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai
BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium,
dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan
eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang
lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam
mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang
terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi).
Kromatografi
65
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
kompleks.
 Kegunaan HPLC

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

66 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Kelebihan HPLC
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya
memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat
yang tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

67 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Kelemahan
Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase
diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel
lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali
dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
68 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
69 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Prinsip kerja
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada
HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar
sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih
cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa
diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair
secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

70 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang
terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya
dengan kromatografi gas.
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi.
Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
71 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
 Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-
senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu

72 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B

 Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat
menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar
komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar
73 (sangat sederhana). New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
74 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
75 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
76 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
77 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
78 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
79 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B
80 New Way Chemistry for Hong Kong A-Level 3B