Laboratorio de Gentica Microbiana

5QV1 Seccin 2 Equipo 7

Integrantes:
Jaimes Silva Lesslie Itzel
Jarez Hernndez Diana Paola
ANTECEDENTES
 1869
Johann
nuclenas
Friedrich
Miesscher

1928
Principio
Frederick
transformante
Griffith

1953,
James
Watson Doble hlice
Francis
Crick
 ADN
El ADN es un polinucletido de
doble cadena cuya misin es
conservar la informacin
gentica, especificando la
secuencia de aminocidos de
todas y cada una de las
protenas celulares.
 COMPOSICIN
La molcula de ADN est constituida por dos cadenas o bandas
formadas por una gran cantidad de nucletidos.
Cada nucletido est formado por:
 Estructura
Una base nitrogenada
unida a un azcar se
llama nuclesido ;
cuando se le aade un
grupo fosfato se
denomina nucletido.

Las bases nitrogenadas son de dos tipos:

PIRIMIDINAS
PURINAS
Poseen un anillo de 6
Poseen anillos de 5 y 6 lados fusionados lados
ESTRUCTURA PRIMARIA

La estructura primaria del

ADN es la secuencia de
nucletidos (unidos por enlaces
fosfodister) de una sola cadena
o hebra.
Se enlazan covalentemente el
grupo OH del carbono 3 de la
pentosa y el grupo fosfato del
carbono 5
Estructura secundaria
La estructura secundaria del ADN es la
disposicin en el espacio de dos
cadenas o hebras de nucletidos
en doble hlice
Ambas cadenas son antiparalelas, pues
el extremo 3 de una se enfrenta al
extremo 5 de la otra.
 hidrofbicas los enlaces que contribuyen a la
formacin de la doble hlice son:

Enlace fosfodister, en la unin de

dos nucletidos.

Enlace N-glucosdico, en la unin

hidroflica de la desoxirribosa y una base
s nitrogenada.

Enlace por puente de hidrgeno,

en la unin de las bases
nitrogenadas (A-T y G-C).
 ESTRUCTURA
TERCIARIA
La estructura terciaria es
la disposicin que adopta
la fibra de ADN de doble
hlice al asociarse con las
protenas para formar los
cromosomas.
 procariotas el ADN se pliega como
una superhlice, generalmente en forma
circular
En eucariotas, dado que la cantidad de
ADN de cada cromosoma es muy grande, el
empaquetamiento ha de ser ms complejo
y compacto
Desnaturalizacin
Las cadenas de ADN se
separan cuando se
rompen los puentes de
hidrgeno existentes
entre las bases.

REVERSIBLE
 Temperatura de fusin ( Tm)
Es caracterstica de la
composicin de bases de
cada DNA.

CyG = Tm.

T C en que del DNA

est desnaturalizado.
 EFECTO
HIPERCRMICO

Incremento de la absorbancia
observado cuando el DNA de
doble Hlice es desnaturalizado a
la forma de cadena sencilla.
 RENATURALIZACIN
Reversible
Cuando las cadenas
complementarias se incuban a una
temperatura de 25 por debajo de su
Tm, comienzan a reasociarse hasta
formar nuevamente la hlice
original.
La renaturalizacin suele medirse
en funcin del descenso de la
absorbancia (Efecto Hipocrmico)
Viscosidad
Las soluciones de
fragmentos largos de DNA
son muy viscosas
 Degradacin
Proceso de fragmentacin de la molcula de
El efecto
DNA hasta la obtencin de los nucletidos
que lo constituyen. hipercrmico
residual se
enzimas
presenta
irreversible
cuando el
polmero se
rompe en sus
mononucleti
dos.
 Artculo
PROPIEDADES DEL ADN
 La obtencin de una molcula de ADN
puro presenta algunas interferencias
durante su aislamiento:
La gran dificultad de mantener una
molcula tan larga y rgida fsicamente
intacta.
El ADN aislado contiene aproximadamente
del 0.1 al 0.2% de protenas ligadas al
material.
 Determinar cualitativamente
y cuantitativamente algunas
caractersticas del ADN para
su caracterizacin.

OBJETIVO
 MTODO DE MARMUR
Degradacin de la Julius Marmur fue un
pared celular mediante bilogo molcular
Lisis celular el uso de Lisozima o estadounidense que
public en 1961 un
detergente. mtodo de aislamiento
de ADN casi libre de
protenas y RNA.
Disociacin
de ADN y NaClO4
protenas

Mezcla de
Eliminacin cloroformo y
de protenas alcohol
isoamlico
 Ribonucleasas o
Eliminacin en un gradiente
Este proceso debe ir
acompaado de
de densidad de
de RNA Cloruro de Cesio agentes quelantes o
un detergente (SDS)
para inactivar las
DNAsas celulares.

Precipitacin Alcohol
isoproplico
de ADN
MTODO DE FENOL CLOROFORMO
Kirby (1968)
Este mtodo permite
Lisozimas o
Lisis celular obtener un ADN con
detergente
menor cantidad de
protenas y enzimas.

Mezcla de fenol,
Precipitacin cloroformo y
de protenas
alcohol isoamlico

Recuperacin de
Agitacin y fase acuosa la
centrifugacin cual contiene
ADN Y ARN
Eliminacin de Cloroform
fenol o

Recuperacin de
Agitacin y la fase acuosa
centrifugacin
Repetir este paso

Precipitacin
de cidos Isopropanol
nucleicos

Etanol al 70%
Lavado del fro
precipitado
 Efecto hipercrmico de los cidos; poliadelico y
poliuridlico.

Los polirriboncletidos
sintetizados artificialmente
cuando se encuentran mezclados
tienen una absorbancia menor a
una longitud de 260 nm.

El efecto hipercrmico se observa

cuando la absorbancia de ambos
polmeros aumenta cuando estn
separados.

Fig.1 Espectro de absorcin de las cantidades equimorales

del cido del cido poliadelico y cido poliuridlico. La
curva superior se refiere a los mononucletidos obtenidos
por hidrlisis alcalina.
 Comparacin de la absorcin de DNA sinttico y
natural.

La absorbancia del ADN

aumenta al ser hidrolizada
por la enzima.

A medida que aumenta la

hidrlisis aumenta la
absorbancia.

Fig. 2 Incremento de absorcin en luz ultravioleta a 260 nm del

DNA natural y sinttico tras la disgestin con
desoxirribonlucleasa pancretica.
 El ADN obtenido de los
organismos vivos
aumenta su absorbancia
a temperaturas mayores
de 69.3 C.

El polmero A-T aumenta

su absorbancia a
temperaturas menores de
69.3C.
Fig.4 Relacin entre el contenido de Guanina + Citosina
a temperatura de desnaturalizacin para varios DNAs
en 0.15 M de NaCl y 0.015 de Citrato.
 Se determin la ecuacin de la recta:
Y= mx + b

Para obtener los valores de Tm

de diversos ADN en base a su
contenido de G-C

El valor de Tm es directamente
proporcional a la cantidad de
G-C en el ADN
Fig.4 Relacin entre el contenido de Guanina +
Citosina a temperatura de desnaturalizacin para
varios DNAs en 0.15 M de NaCl y 0.015 de Citrato.
Ecuacin de Marmur y
Dorty
Para describir el efecto hipercrmico
cuantitativamente, podemos definirlo en
trminos de una temperatura Tm.

Donde:
(G + C) es el contenido de Guanina + Citosina
en porcentaje molar del total del contenido de
bases.
 Cuando la solucin de ADN es
enfriada rpidamente la
densidad ptica no regresa a su
valor original incluso a 25C.

La solucin de ADN calentada

y enfriada lentamente regresa
casi a su valor original de
absorbancia a 25C.

La temperatura ptima para

la renaturalizacin del ADN
es aproximadamente de 25C
Fig.3 Efecto hipercrmico del caletamiento y posterior
rpido o lento enfriamiento del DNA proveniente del
bacterifago T2.
Objetivo
Aislar DNA cromosmico a partir de un
cultivo de Escherichia coli
Caracterizar el DNA aislado pureza y
concentracin
Determinar la influencia de algunas
caractersticas de la secuencia del DNA
sobre su desnaturalizacin empleando el
programa bioinformtico DNAMAN
CEPAS

Escherichia coli
W3350
Gram negativo
 DA 1 PROTOCOLO
 DA 2
 DA 3
tubo T C DNA
cromoso
mico

1 75
2 79
3 83
4 87
5 90
6 93
Determinacin de la [] de DNA
0.1 mL solucin =
260
DNA +1.9 mL sol

salina estril
C= concentracin (mg/mL)
Ae= ndice de absorcin
especifica (22500 para DNA)
b= paso de la luz de la celda,
Leer absorbencia en cm
a 260 y 280 nm
 1 unidad de
As260nm de DNA 50 l/mL DNA de
de doble cadena doble cadena

Pureza 260
= >1.8 = mayor
280 pureza o calidad
 Tm DNA
Punto medio de la recta
e interpolar

= 69.3 + 0.41 +

G+C= % de guanina +
citosina del total de las
bases
 Influencia de los
diferentes parmetros
sobre la DNAMAN
desnaturalizacin del
DNA

Influencia del contenido de GC

Influencia de la variacin en la
secuencia de nucletidos
Influencia de la longitud de la
secuencia de nucletidos
Determinar la Tm de los
oligonucletidos
 Disear 3 oligonucletidos de 40 residuos con diferentes relaciones
GC/AT

Disear 3 oligonucletidos de 40 residuos con la misma relacione GC/AT

pero diferente secuencia de nucletidos

Disear 3 oligonucletidos con la misma relacione GC/AT pero con

diferente tamao (Ej. 20, 30, 60 nucletidos )
Escribir la secuencia de
oligonucletidos (20 y 40
pares de bases) en
secuencia de cadena
sencilla
Blibliografa
Adams R.L.P. ,Burdon, RH., Campbell, A.M., Smellie, R.M.S. (1980) Bioqumica
de los cidos Nucleicos de Davidson. Revert, S. A. pp. 49-111.
Campbell, M.K., Farrel, S.O. (2009) Biochemistry. Cengage Learning, pp 241-
242.
Espinosa L. A. Experimentos en gentica microbinana, Mxico 2017. Pp 1-11.
Lehninger, A. L. principios de bioqumica quinta edicin. Ediciones omega.
Barcelona 2009. Pp1975 271-303, 882-893
Rudin, N., Inman, K. ( 2002.)An introduciton to forensic DNA analysis. CRS
Press. pp. 103-104
Zavala C.J. (2005) Manual de Tcnicas Bsicas de Biologa Molecualar. Ediciones
de la Universidad Autnoma de Yucatn. pp. 38-46.