Valora las muestras de los

SEMINARIO 1 Mtodo de Sato y Sekiya para pacientes, teniendo la

Estudio histoqumico de enzimas. Fijacin. demostrar actividad de peroxidasa en obligacin de manipularlos
Mtodos usados para su demostracin. Mtodos frotices de sangre perifrica. con respeto y esmero
diferenciales para su estudio. Mtodo de Gomori para demostrar Participa activamente en la
Peroxidasa. Fijacin. Mtodos usados para su actividad de fosfatasa alcalina en preparacin de los reactivos.
demostracin. Utilidad y limitaciones de los frotices de sangre perifrica.
mtodos.
Fosfatasa alcalina. Fijacin. Mtodos usados para
su demostracin. Utilidad y limitaciones de los
mtodos.

Estudio histoqumico de enzimas

Alumna: Cordero Castro Noga

La histoqumica enzimtica o histoenzimologa se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido
de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijacin.

Estas enzimas y las clulas que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reaccin enzimtica que
convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados.
Los sustratos son especficos para el enzima y los productos se
depositan en el lugar preciso donde se produjo la reaccin, es
decir, donde se localiza el enzima.

Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las:

Peroxidasas
Fosfatasas
Deshidrogenasas
Diaforasas
Acetilcolinesterasa
etctera.
Hay que tener en cuenta que cuando queremos
detectar una actividad enzimtica es recomendable no
incluir el material en medios como la parafina puesto
que la deshidratacin y la temperatura elevada
pueden daar la conformacin de la enzima y por
tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas
tcnicas se realizan normalmente en secciones
obtenidas por congelacin.
Va fosfatasa y esterasa:

La reaccin enzimtica quita grupos fosfato o naftilo y en este caso el indicador colorimtrico son
sales de diazonio. En el captulo de inmunohistoqumica se muestra de qu manera se utilizan
como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro.

Las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina. Estas enzimas hacen
cambiar de color los sustratos de diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y
nitroazul de tetrazolio (color azul). Pueden usarse a la vez, en combinacin.

Esta reaccin enzimtica puede hacerse directamente sobre el anticuerpo primario o

indirectamente, mediante anticuerpos secundarios o sustancias como biotina. Todas las tcnicas
deben tener controles positivos y negativos. Habitualmente se incluye un pequeo cilindro de
reactividad conocida en cada porta.
Tcnicas de tincin para la determinacin de enzimas

En casi todas las tcnicas histoqumicas que se han venido utilizando para ver las
enzimas y localizarlas en los tejidos, el producto final de la reaccin debe ser insoluble.

El resultado de estas tcnicas puede ser visible en funcin de tener alguna de las
siguientes propiedades:

Opaco a la luz blanca, luz ultravioleta o haz de electrones en microscopa

electrnica.
Luminiscencia, tanto fluorescencia como fosforescencia.
Incremento del ndice refractivo.
Reflectividad (fraccin de radiacin incidente reflejada por una superficie).
Manejo de los tejidos

Casi todas las tcnicas se realizan con tejido congelado, porque la mayora de las enzimas se inactivan
por fijacin con formol.

Se recomienda congelar las muestras en hielo seco (CO2) a -80 C o en isopentano en un congelador (-
25 C), en un pequeo tubo Eppendorf (biopsias) o bolsa de plstico (resecciones quirrgicas).

Es importante el espesor mnimo de seccin en criostato. Es recomendable realizar cortes finos. En

algunas tcnicas resulta complicado el uso de controles o muestras de referencia con una actividad
enzimtica conocida o estandarizada, que suelen estar disponibles comercialmente.
Aplicaciones

La acetilcolinesterasa es la ms comnmente usada.

Es clave para el diagnstico de la enfermedad de Hirschprung (enfermedad congnita en la que faltan clulas
del sistema nervioso de la pared del colon).

La fosfatasa alcalina es una enzima importante en la barrera hematoenceflica, la mucosa dental y el tbulo
proximal del rin.

Una disminucin de la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina indica deterioro funcional grave.

Un aumento de actividad de la fosfatasa alcalina lisosomal es un marcador temprano de lesiones isqumicas

(falta de oxgeno) de los tejidos.

La clasificacin de enfermedades musculares, miopatas y distrofias.

Las reacciones de histoqumica enzimtica ms frecuentemente usadas son ATPasa a pH 4,5 y 9,4,
deshidrogenasa succnica, NADH, fosforilasa y citocromo C oxidasa (COX).