MICROSCOPIA

EL MICROSCOPIO

El microscopio (de micro-, pequeo, y scopio, observar)

Permite observar objetos que son demasiado pequeos
para ser vistos a simple vista.
El tipo ms comn y el primero que se invent es el
microscopio ptico.

Unidades de medida

Se miden en unidades muy pequeas:

micrmetros,
nanmetros
angstroms.
Un micrmetro (m), conocido antes como micra (), equivale
a 0,000001 m.
UNIDAD

CLASIFICACIN DE MICROSCOPIOS
1
Segn la fuente de emisin.
Segn el nmero de lentes.

Los microscopios, segn la fuente de emisin son:

MICROSCOPIO PTICO MICROSCOPIO ELECTRNICO

TIPOS DE MICROSCOPIOS, SEGN EL NMERO DE LENTES

Microscopios

Estereoscpicos
Compuestos
o lupas

M. ptico, M. contraste M. de
M. Electrnico
corriente de fases fluorescencia

M. E. de transmisin

El lmite de los microscopios pticos est alrededor

de 1500X. Esto est relacionado con la longitud de
onda de la luz visible. M. E. de barrido
(SEM)
RANGO DE TRABAJO DE LOS MICROSCOPIOS
 MICROSCOPIO ESTEREOSCPICO
Tambin llamado lupa binocular
Hace posible la visin
tridimensional de los objetos.
Consta de cuatro espejos,
ubicados en forma tal que permiten
desviar las imgenes
correspondientes a cada ojo
puestas una al lado de la otra de tal
manera que al verse montadas dan
el efecto tridimensional.
Ofrece ventajas para
observaciones que requieren
pequeos aumentos.
El ptimo de visin estereoscpica
se encuentra entre 2 y 40X.
 MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
Basado en lentes pticos.
Llamado tambin microscopio de campo claro.
Poseen dos lentes que producen una imagen ampliada, vertical e
invertida al objeto
Tiene un lmite de resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m).
Aumenta las imgenes hasta 1000 veces aprox.
El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, o trinocular.
Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o
fijadas y teidas.
Para observar las muestras es necesario realizar tinciones para
aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos y el
medio.
Este aumento se logra cuando los rayos de luz procedentes de la fuente
luminosa han pasado a travs de un condensador, que los dirige a travs
de la muestra; a continuacin entran en las lentes del objetivo, las ms
prximas al espcimen y la imagen obtenida es ampliada de nuevo por
las lentes del ocular.
 PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

1 Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta

y ampla la imagen formada en los objetivos.
2 Objetivo: lente situada cerca de la preparacin. Ampla la
imagen de sta.
3 Condensador: lente que concentra los rayos luminosos
sobre la preparacin.
4 Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
5 Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
6 Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante
una cremallera que sostiene al lente ocular y al revlver
porta objetivos.
 PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
7 Revlver: Tambor que sostiene a las lentes objetivos, y que
rota para utilizar un objetivo u otro.
8 Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque,
mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo
hace mediante grandes desplazamientos y el micromtrico con
pequeos, permite ajustar el enfoque.
9 Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central,
sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de
los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por
debajo. Dos pinzas sirven para sujetar el portaobjetos sobre la
platina la cual puede tener un mecanismo llamado charnela o
vernier guiado por dos tornillos de desplazamiento que permite
mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a
derecha y viceversa.
10 Base: Tambin llamada Pie es la parte inferior del
microscopio que permite el sostn del mismo.
UNIDAD

PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO

1
Sus principales componentes son:

Oculares. Lentes a travs de las que se

observa la preparacin ampliada.

Objetivos. Lentes que aumentan el tamao

de la imagen.

Platina. Sobre ella se coloca la

preparacin, que se sujeta con una pinza.

Iluminacin. Espejo o lmpara que ilumina la

preparacin.

Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba

o abajo para enfocar la imagen.
 SISTEMAS DEL MICROSCOPIO OPTICO
El sistema mecnico est compuesto por el conjunto de
piezas de sostn y desplazamiento que permiten el enfoque
del objeto a observar, estas son: base o pie, brazo, tubo o
can, cremallera, tornillos micro y macromtrico,
revlver portaobjetivos y platina.

El sistema ptico corresponde al conjunto de piezas que

colaboran en la ampliacin de la imagen, es decir:
objetivos y oculares que son las lentes del microscopio

El sistema de iluminacin comprende aquellos

componentes encargados de hacer llegar la luz, dosificarla
y dirigirla a travs del preparado, estos son: espejo,
condensador y diafragma.
 SISTEMA MECNICO
Tubo o can, Cremallera, Tornillos macro y micromtrico,
Brazo, Tambor o revlver portaobjetivos, Platina, Pie o base
 EFECTO DEL MICROMTRICO

Moviendo el tornillo micromtrico (nunca ms

Aqu, logramos ver los cloroplastos de estas
de una vuelta) alternativamente hacia delante
clulas vegetales al mover ligeramente hacia
o hacia atrs, podremos apreciar nuevos
atrs o hacia delante el tornillo micromtrico
detalles en la preparacin
SISTEMA PTICO

Lente ocular
Lentes objetivos

Posee varios lentes en el objetivo y varios en el ocular. El

objetivo de esas lentes es el de reducir la aberracin
cromtica y la aberracin esfrica.
Se utilizan para observar objetivos delgados, dado que su
profundidad de campo es muy limitada.
Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra
desde abajo, y puede requerir tcnicas especiales para
aumentar el contraste de la imagen.
 PARTES PTICAS
Oculares: Son cilindros huecos
provistos de lentes convergentes
cuyo aumento se indica en la parte
superior de los mismos
(normalmente 10X). Dependiendo de
que exista uno o dos oculares, los
microscopios pueden se mono o
binoculares.
Objetivos: son sistemas de lentes
convergentes que se acoplan en la
parte inferior del tubo, mediante el
revlver. En esta estructura se
pueden acoplar varios objetivos
(ordenados de forma creciente
segn sus aumentos, en el sentido
de las agujas el reloj). El aumento de
cada objetivo, tambin va indicado
en el lateral del mismo.
 COMPONENTES PTICOS

OBJETIVOS

OCULARES
 SISTEMA DE ILUMINACIN
Diafragma o iris: Acta sobre el reflector de la fuente de
iluminacin. Abrindolo o cerrndolo permite graduar la
intensidad de la luz.
Condensador. sistema de lentes convergentes que capta los
rayos de luz y los concentra sobre la preparacin, de manera
que proporciona mayor o menos contraste.
Espejo o fuente de luz
SISTEMA DE ILUMINACIN
 EFECTO DEL DIAFRAGMA
Objetivo mayor menor campo, menor profundidad de
campo o de enfoque
Objetivo menor mayor campo,
mayor profundidad de campo o
Si cerramos el diafragma Si abrimos el diafragma de enfoque
mayor profundidad de menor profundidad de
campo, pero menos luz campo, pero ms luz

Dependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en

correspondencia, mayor o menor profundidad de campo
UNIDAD

IMGENES CON EL MICROSCOPIO PTICO

1
Este tipo de microscopio Levaduras
permite observar clulas
vivas y los movimientos
que realizan, en su medio.

Protozoos
 PREPARACIN DE MUESTRAS PARA
MICROSCOPA PTICA
Como la mayora de los microorganismos aparecen casi incoloros
al microscopio ptico normal, a menudo es necesario prepararlos
para la observacin. Una forma de hacerlo es mediante tincin.
Sin embargo, para poderlos teir es necesario que los
microorganismos hayan sido adheridos o fijados al portaobjetos; de
otro modo la tincin podra eliminarlos por lavado.
Para fijar una muestra se comienza por extender una delgada
pelcula del material que contiene los microorganismos sobre la
superficie del portaobjetos.
Despus de dejarla secar al aire el portaobjetos se pasa
lentamente a travs de la llama de un mechero varias veces, con el
lado de la extensin haca arriba. El flameado desnaturaliza
(coagula) las protenas microbianas y adhiere a los
microorganismos sobre el portaobjetos. Este procedimiento de
fijado suele matar al microorganismo. Se aplica luego el colorante,
lavndolo despus con agua.
 TINCION
La mayora de las clulas bacterianas resultan difciles de ver con
el microscopio ptico, debido a su tamao y a la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea
Se aumenta ese contraste con la utilizacin de colorantes.
Para mejor contraste, debe usarse un tinte segn la composicin
qumica de las partes de la clula.
Los colorantes utilizados son compuestos orgnicos con grupos
cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos.
Cromforos Son grupos funcionales de la molcula responsables
de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces
carbono-carbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino
(C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares
libres).
Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si solo
pero que tiene el efecto de desplazar picos de los cromforos hacia
longitudes de onda larga y aumentar sus intensidades: metilo,
halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.
 TINCIONES

Simples: uso de un solo

Positivas: se emplean colorante. Sirven para
colorantes que tien al distinguir formas.
microorganismo y no al
medio.
Diferenciales: uso de un
2 tipos de colorante inical y luego un
tinciones colorante de contraste. Sirven
para diferenciar distintos tipos de
celulas (Ejemplo: tincion Gram)

Negativas: se emplea colorantes que no tienen afinidad

por los constituyentes celulares (Ejemplo: nigrosina,
tinta china). Tien al medio y no las bacterias.
 TIPOS DE COLORANTES

Catinicos (carga +): se combinan con los

constituyentes celulares cargados negativamente tales
como cidos nucleicos, polisacaridos cidos y
superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta, Safranina.
Aninicos (carga -): se combinan con constituyentes
celulares cargados positivamente, tales como
numerosas protenas. Ejemplos: Eosina, Fucsina acida y
Rojo Congo.
Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas.
Ejemplos: Sudan negro.
 MORDIENTES

Son sustancias capaces de formar complejos

insolubles con los colorantes y que ayudan al proceso
de coloracin.
Algunos colorantes tien mejor, cuando la clula es
tratada con un mordiente

Ejemplos de mordientes comnmente usados son el

Lugol, el cido tnico y algunas sales.
 COLORANTES HISTOLGICOS MS COMUNES
Azul brillante de Coomassie.-Tie a todas las protenas de color
azul. Se utiliza en electroforesis.
Azul de metileno.-Se usa para teir clulas animales, hacer ms
visibles sus ncleos.
Azul Nilo.-Tie clulas vivas, y a los ncleos de color azul.
Bromuro de etidio (BE).Se adhiere al ADN y le da color rojo
naranja fluorescente.
No tie clulas vivas, pues no atraviesa las membranas, pero se
utiliza para identificar clulas en proceso de apoptosis, ya que
tales clulas poseen unas membranas mucho ms permeables.
Carmn.-Es de un intenso color rojo, y como sal de litio tie
glucgeno. Las sales de alumbre-carmn son colorantes que se
adhieren al ncleo. Las tinciones con carmn requieren un
mordiente; Al o alumbre.
Cristal violeta-. Con un mordiente adecuado, tie las paredes
celulares de color prpura.
 TIPOS DE TINCIN
TINCIN IN VIVO (en fresco y vital).
Se aplican para incrementar el contraste de las clulas, por
los procedimientos simples de tincin.
Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente
se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5000 a
1:50000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente
txicas para los organismos.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno. El azul de
metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas
las clulas bacterianas rpidamente.

TINCIN IN VITRO (colorantes no vitales). Involucra el

coloreo de clulas o estructuras que han sido removidas de
su contexto biolgico.
Ejem: tincin Gram.
 OBSERVACIN EN FRESCO Y COLORACIN VITAL.
Cuando se desea observar clulas sin afectar
su viabilidad, se realiza una observacin en
fresco (sin colorear) o utilizando colorantes
diluidos como cristal violeta 1/5000. Con esta
tcnica se observa la morfologa y
agrupacin movilidad celular.

Observacin en fresco. Tcnica.

- Sobre un portaobjetos se coloca una gota de
agua y forma una suspensin de la muestra.
- Se coloca un cubreobjetos.
- Se observa con poca luz.

Coloracin vital.
El procedimiento es similar al paso de la
observacin en fresco.
 TCNICAS PARA LA OBSERVACIN VITAL:
a) Examen en fresco.
Preparaciones hmedas: para observar organismos acuticos
microscpicos (algas, larvas, etc.). Se pone una gota del lquido
que los contiene sobre el portaobjetos y se pone el cubreobjetos
con cuidado para que no aparezcan burbujas de aire.
Gota pendiente: se utilizan portaobjetos excavados sobre los que
se pone el cubreobjetos, que lleva adherido la gota del lquido que
ha de ser observado. As podemos observar el movimiento de los
microorganismos en el medio lquido, sin que estn sometidos a
la presin entre portaobjetos y cubreobjetos. Esta tcnica
presenta varios problemas que hay que tener en cuenta:
1. La gota constituye una lente trmula que desva los rayos de luz
e interfiere con la iluminacin, esto resulta muy molesto cuando se
emplea microscpio de contraste de fases.
2. Los portaobjetos excavados actan como una lente divergente
que puede modificar la realidad de lo que se est observando.
-Examen en fresco con nigrosina: esta tcnica consiste en aadir
nigrosina, se prefiere a la tinta china, al objeto de estudio. Con este
mtodo podemos distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro.
Se utiliza sobre todo para el estudio de detalles estructurales como
cpsulas y flagelos. Se utiliza el objetivo de inmersin.

En el examen en fresco se pueden utilizar dos tipos de

medios, los lquidos fisiolgicos o los lquidos de adicin.

Los lquidos fisiolgicos son los que conservan las condiciones ms

parecidas a aquellas en las que se desenvuelve el microorganismo
vivo.
Los lquidos de adicin se utilizan para aclarar los objetos de
estudio poco transparentes (insectos, pelos, fragmentos vegetales)
y as hacerlos visibles. Como lquidos de adicin se utilizan el
lactofenol o KOH
b) Coloracin vital.
Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al
organismo.
En general no tien, sino que se acumulan en determinadas zonas
de la clula. Como todo colorante es una sustancia txica, por lo
que hay que emplear bajas concentraciones. Como colorantes
vitales se utilizan el azul de metileno, el rojo neutro, el rojo congo, el
verde Jannus.
La coloracin en vivo se puede hacer de dos maneras:
1. Por difusin: en el espacio entre portaobjetos y cubreobjetos de
una preparacin en fresco, se pone una gota de colorante que
penetra en la muestra por capilaridad.
2. Mezclando una gota de colorante con el material que ha de
ser examinado en el portaobjetos y colocando luego el
cubreobjetos. Tanto en un examen en fresco como en una
coloracin vital pueden realizarse procedimientos de micro
compresin, disociacin, e incluso fragmentacin.
 ESTUDIO IN VITRO".
Consiste en la observacin de clulas y tejidos muertos. Para ello
se realizan una serie de pasos, como son la fijacin, la inclusin, el
corte (microtomia), la tincin y el montaje.
l. Fijacin:
Mecanismo que consiste en matar a la clula lo ms
rpidamente posible, para permitir que se mantengan las
propiedades fisiolgicas y morfolgicas del organismo vivo. Los
fijadores solidifican el coloide protoplasmtico mediante
coagulacin o precipitacin, convirtindolo en un gel insoluble. La
fijacin evita que el tejido se pudra y se desintegre, produciendo
puentes entre protenas y diferentes materiales de los tejidos. 24
horas despus se proceder a la inclusin.
Hay diferentes tipos de fijador:
- Fsicos: calor (hmedo o seco), fro (congelacin rpida).
- Qumicos: segn la base fijadora: alcohol metlico, dicromato de
potasio, erlinck, formol 10% tamponado.
2. Inclusin:
Para poder cortar la pieza, sta debe tener una cierta consistencia. Para
endurecerla, la incluimos en un material que llegue a todas las estructuras celulares.
Esta debe ser una sustancia con plasticidad como la parafina, el colodin o la
gelatina. La inclusin nos permite conservar la muestra durante largo tiempo. Lo
ms corriente es utilizar la parafina.
Por ello detallamos el proceso de inclusin en ella:
a) Deshidratacin: proceso necesario para que, a pesar de la insolubilidad de la
parafina, sta pueda impregnar la pieza. Consiste en hacer pasar la muestra por una
escala creciente de alcoholes. Los tiempos dependen de si el proceso se realiza
manualmente o automticamente, en cuyo caso se utiliza un histoquinter.
b) Aclaracin: se baa la pieza tres veces durante unos 30-40 minutos en un
disolvente de la parafina, como el xilol, el benzol o el tolueno.
c) Impregnacin en parafina: para evaporar el disolvente de la parafina y que sta
pueda penetrar en la pieza, se la incluye en parafina fundida dos veces, durante 5
horas cada vez. Para que la parafina est fundida debemos tenerla 24 horas a 56-
60C.
d) Inclusin definitiva: la pieza se mete en parafina fundida depositada en moldes,
normalmente en "cassettes" de parafina, para que al enfriarse podamos obtener
bloques de parafina que incluyen la pieza.
3. Corte:
La obtencin de cortes para su estudio microscpico se realiza mediante
unos aparatos llamados micrtomos.
Hay de diferentes tipos que se eligen dependiendo de la textura del
material que se ha de estudiar.
Se pueden obtener diferentes grosores de cortes. Hay cortes finos, que
tienen de 5 a 10 m de grosor, y semifinos que tienen entre 0,5 a 5 m
de grosor. Los cortes semifinos se realizan a partir de material incluido en
plstico y no en parafina.
Los cortes obtenidos se planchan en la superficie de un bao mara a
45C con un 5% de gelatina, y se pescan con el portaobjetos.
Tambin se pueden realizar cortes a partir de material no incluido en
parafina, mediante congelacin. Esta tcnica es muy interesante por su
rapidez, pero slo se pueden obtener cortes de 60 a 80 m de grosor.
Los cortes, una vez recogidos y puestos en agua, se tien para evitar que
se sequen.
4. Tincin:
Para teir los cortes stos no deben tener parafina porque si no,
no penetrara el colorante. Por ello, si antes han sido incluidos en
parafina, se elimina sumergiendo los cortes 15 minutos en xilol
Tambin se elimina el xilol hacindolos pasar por alcohol absoluto,
alcohol 90, alcohol 70 y agua destilada.
Una vez eliminada la parafina, o bien utilizando los cortes que no
haban sido incluidos en ella, se procede a la tincin.
Hay muchos tipos de tinciones, muchas de ellas especficas para
poder observar determinadas estructuras:
5. Montaje:
-Gota pendiente: ya explicado anteriormente. Se untan los
bordes del cubreobjetos con vaselina para conseguir adherencia
y que no se seque la muestra, si se va a observar durante ms de
una hora.
Aplastamiento: es la tcnica ms comn. Los cortes se depositan en
el portaobjetos. Si no se quiere conservar la preparacin, no
aadiremos medio de montaje, slo pondremos el cubreobjetos, pero
la preparacin no durar ms de una hora, ya que su contenido lquido
se evaporar por el calor emitido por el foco luminoso.
Si la preparacin se quiere conservar, utilizaremos un buen medio de
montaje que debe cumplir una serie de propiedades como tener un
buen ndice de refraccin, un pH neutro, y un secado rpido.
Tradicionalmente se ha venido utilizando el blsamo de Canad, que
actualmente ha sido sustituido por resinas sintticas, como el Eukitt.
Gracias al medio de montaje, la preparacin se conservar durante
mucho tiempo. Una vez aadida la gota de medio de montaje, se cubre
con el cubreobjetos y se espera a su secado.
6. Etiquetaje:
Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren conservar
o se van a utilizar posteriormente. En la etiqueta se pone el nombre del
material, la especie, la tcnica utilizada y la fecha de realizacin.
(Arraiza, et al)
 TINCIN
Se utilizan sustancias que no penetran en la
clula y tie el fondo quedando los NEGATIVA.
microorganismos incoloros.
Normalmente el tamao de las bacterias
observadas por esta tcnica es mayor que el real
y no debe utilizarse para la medicin de
microorganismos.
Con este mtodo pueden observarse morfologa
y agrupacin as como tambin estructuras
extracelulares como la cpsula.
TCNICA.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de
un asa, una gota de una solucin acuosa de
nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la
gota de nigrosina y extender en forma de valo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar
con objetivo de inmersin.
 Tcnica de observacin en frotis (Pelcula)
a)La preparacin del frotis consiste en extender
homogneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano)
o una suspensin de la misma sobre una lmina.
b)La fijacin. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (
con calor, formaldehido, cidos o alcoholes). Se obtiene la muerte
de los microorganismos, la adhesin a la lmina y la conservacin
de su morfologa.
c)Coloracin. Despus de preparar y fijar el frotis, se puede
realizar cualquier tipo de coloracin (simple o diferencial).

La fijacin produce encogimiento de las clulas, y la tincin hace

que las clulas aparezcan mayores de lo que son, de manera que
las medidas de las clulas tratadas no pueden hacerse con
precisin
Para aplicar los colorantes cidos o bsicos los microbilogos utilizan
tres tipos de tcnicas de tincin: simple, diferencial y especial.
Tinciones simples
Un colorante simple es una solucin acuosa o alcohlica de un slo
colorante bsico.
Aunque distintos colorantes se unen especficamente a partes
diferentes de la clula, el objetivo primario de una tincin simple es
destacar al microorganismo entero, de forma que la morfologa y las
agrupaciones celulares resulten visibles.
El colorante se aplica a la extensin fijada durante un tiempo
determinado; despus se lava y la preparacin se seca y se examina.
Ocasionalmente se aade un compuesto qumico a la solucin para
intensificar la tincin.
Un aditivo de este tipo se conoce como mordiente. Algunos de los
colorantes simples utilizados corrientemente en el laboratorio son el
azul de metileno, la carbol-fucsina, el violeta de genciana y la
safranina.
Tinciones especiales
Las tinciones especiales se utilizan para teir aisladamente partes
especficas de los microorganismos, como endosporas y flagelos y para
poner en evidencia la presencia de cpsulas.

Tincin negativa de cpsulas

Muchos microorganismos poseen una cubierta gelatinosa llamada
cpsula. En microbiologa clnica la demostracin de la presencia de
cpsula es un medio para determinar la virulencia de un
microorganismo, la capacidad de un patgeno para producir
enfermedad.
La tincin de cpsulas es ms difcil que otros tipos de tincin porque
los materiales capsula) son solubles en agua y pueden ser desplazados o
eliminados durante los lavados. Para demostrar la presencia de cpsula
pueden mezclarse las bacterias con una solucin que contenga una
solucin coloidal de pequeas partculas coloreadas (tinta china
generalmente que sirva de fondo y teir despus las clulas el un
colorante simple como la safranina.
Tincin de esporas (endosporas)
Aunque son relativamente poco frecuentes en las clulas
bacterianas, seis gneros de bacterias pueden formar
endosporas.

La endospora, formada dentro de la clula, protege al

microorganismo de las condiciones ambientales adversas.
Las endosporas no pueden ser teidas por los mtodos
corrientes como la tincin simple o la de Gram, porque los
colorantes no atraviesan la pared de la endospora.

Sin embargo, las endosporas son muy refrctiles y pueden

detectarse fcilmente al microscopio ptico.
 TINCIN DE ESPORAS

Protocolo:

1) Preparacion del extendido y fijacion por calor.

2) Cubrir con verde de malaquita calentando
durante 3 minutos.
3) Lavar con agua.
4) Agregar colorante de contraste (safranina).
5) Lavar con agua.
 TINCIN DE ESPORAS
Clasificacin en funcin de su posicin
 TINCIN SIMPLE
Tincin de clulas para
la observacin microscpica

Extensin de una fina capa

de clulas sobre el porta

Adicin del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Se coloca una gota de aceite

de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
Fijacin por flameado del porta 100X
 TINCIONES ESPECIFICAS
TINCIN DIFERENCIAL.

No tie a todas las clulas por igual.

La ms utilizada es la tincin de Gram.
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Tincin de Gram. Fue ideada por el bacterilogo dans Christian
Gram en 1883.
tiene importancia en taxonoma bacteriana, e indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias.
 TINCION GRAM.
Procedimiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con
una solucin de cristal violeta y luego son lavadas para quitar el exceso
de colorante. Tanto Gram (-) como Gram (+), se tien de azul violaceo.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2)
yoduro potsico (KI), donde el ingrediente activo es el yodo. Este entra
en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta.
Tanto las clulas gram (+) como las gram (-) se encuentran teidas.
Despus se decolora, usando alcohol o acetona, sustancias en las que
es soluble el complejo yodo cristal violeta.
Los organismos Gram (+) no se decoloran mientras que los Gram (-) si
lo hacen. La diferencia entre los dos tipos de clulas est, por lo tanto,
en la resistencia a la decoloracin.
Para colorear las clulas gram (-) se utiliza un colorante de color rojo,
como la safranina o la fucsina bsica.
Despus de la coloracin de contraste las clulas gram (-) son rojas
mientras que las grampositivas permanecen azules violaceas.
 TINCIN GRAM

Gram + Gram _
2) Fijar el material
Una vez que el material esta seco, pasar
el portaobjeto sobre el mechero.

3) Cubrir el portaobjeto con

Cristal violeta
Se deja el colorante durante 20
segundos.

4) Lavar con agua

 TINCIN GRAM

Gram + Gram _
5) Agregar el mordiente (lugol)
(Lugol: solucion de I2 y KI). Se deja actuar el
mordiente durante 20 segundos y luego se
lava con agua.

6) Agregar el decolorante
(Decolorante: solucion de acetona y EtOH).

El agregado del decolorante produce una DESHIDRATACIN de la pared de

pptido glicano que la transforma en una barrera fsica impermeable al
solvente.
Como consecuencia se impide el lavado del cristal violeta, quedando
atrapado en el interior de las bacterias Gram +.
 TINCIN GRAM

Gram + Gram _

7) Agregar el colorante de
contraste (safranina)

8) Lavar con agua

 TINCIN GRAM
Rosa (Gram -)
Violeta (Gram +)
TINCIN DE ACIDO RESISTENCIA (ZIEHL-NEELSEN)
Permite distinguir bacterias del genero Mycobacterium. Estas poseen en su
pared acido micolico (hidroxilipido de cadena ramificada que se encuentra
acomplejado al peptidoglicano de la pared celular.
MICROSCOPIO PTICO DE CAMPO OSCURO
Producen un efecto de fondo oscuro sobre
el que se ven los objetos intensamente
iluminados.
-Se coloca una placa opaca entre el
condensador y la muestra.
-Solo los rayos reflejados o difractados
entran al objetivo.
-Se obtiene una imagen con fondo oscuro y
la muestra iluminada.

El objeto iluminado dipersa la luz y se hace

as visible contra el fondo oscuro que tiene
detrs, como las partculas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela
en una habitacin cerrada

El condensador comn se sustituye por uno

de campo oscuro, a travs del cual pasa
solamente un cilindro hueco de luz.
 MICROSCOPIO PTICO DE CAMPO OSCURO

Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos

biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin
normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.

Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras,

mientras que las superficies y partculas se ven brillantes.
 MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
Convierte pequeas diferencias de
ndices de refraccin en variaciones
detectables por el ojo.
- Mediante un condensador y un
objetivo especial se controla la
iluminacin de tal manera que
vaya en diferentes rutas a travs
de las distintas partes de una
clula.
- El resultado es una imagen con
diferentes grados de brillo y
oscuridad.
-Permite observar estructuras sin
necesidad de fijar las muestras.
 MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

Con este mtodo, el material

denso aparece brillante, mientras
que las partes de la clula que
tienen una densidad cercana al
agua (citoplasma) aparecen oscuras.
Se observan imgenes con el fondo
claro (rayos no desviados) y las
muestras oscuras con limites bien
definidos.
 MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Usa luz U.V. De 100 y 380 nm.
Esta luz excita ciertas sustancias que
emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que
son visibles.

La imagen observada es el resultado de la

radiacin electromagntica emitida por
las molculas que han absorbido la
excitacin primaria y reemitido una luz
con mayor longitud de onda.

Algunos materiales no requieren

colorantes pues tienen fluorescencia
propia y otros deben ser teidos con
colorante fluorescente.

Para dejar pasar slo la emisin

secundaria deseada, se deben colocar Clulas epiteliales , triple coloracin:
filtros apropiados debajo del condensador ncleo (azul), microtubulos (verdes),
y encima del objetivo actina (rojo).
 MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Los componentes de este tipo de
microscopio son:
Una fuente de luz que emite en
una banda de longitudes de onda
desde el ultravioleta al infrarrojo.

Un filtro que delimita la banda de

excitacin, que normalmente es la
ultravioleta.

Una muestra fluorescente

Segundo filtro (filtro de

barrera"), que corta los restos de la
luz de excitacin y deja pasar slo
la fluorescencia.
Es un microscopio cuya MICROSCOPIO
estructura est invertida en INVERTIDO
comparacin al microscopio
convencional.

permite observar organismos o

tejidos en cultivo sin una
preparacin previa, favoreciendo
el monitoreo del estado de
crecimiento, comportamiento y
dems parmetros involucrados
en el desarrollo del cultivo.

La fuente de luz est ubicada

por encima de la platina y el
principio de formacin de imagen
es el mismo que el del
microscopio de campo claro.
 MICROSCOPIO INVERTIDO
Utilizado principalmente para
cultivos celulares y para
monitorear el crecimiento y
comportamiento. frascos Corning

La primer desventaja es el costo.

Otra desventaja es su limitada
magnificacin, pues el objetivo
ms potente es de 60X.

Actualmente se estn placas de Terasaki

comenzando a fabricar objetivos

de 100X que se utilizan en aceite
de inmersin, sin embargo son
bastante costosos y escasos.
COMPARACIN ENTRE TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio de Microscopio de
Microscopio de Fluorescencia
Campo Claro Contraste
Alga verde de Fases
Bacteria filamentosa Saccharomyces
(eucariota) Teida con naranja cerevisiae
de acridina
 OPERACIN DEL MICROSCOPIO OPTICO
1. Coloque el objetivo de menor aumento en posicin de empleo, y
baje la platina completamente.
2. Colocar la preparacin sobre la platina, y sujtela con las pinzas.

Realizar el enfoque:
1. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin,
empleando el tornillo micromtrico. Eso debe hacerse mirando
directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de
incrustar el objetivo en la preparacin.
2. Mirando a travs de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo, con el macromtrico, y cuando se observe ntida la
muestra, girar el micromtrico, hasta obtener un enfoque fino.
1. Pasar al siguiente objetivo. La imagen deber estar ya casi
enfocada, y suele ser suficiente con mover un poco el
micromtrico para lograr el enfoque fino.
MANTENIMIENTO Y PRECUACIONES

1. al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de menor

aumento
2. cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar que
se ensucien los lentes.
3. nunca tocar los lentes con las manos
4. despus de usar el objetivo de inmersin, limpiar el
aceite con pauelos para ptica, con alcohol
isoproplico o metanol.
 POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN.
Podemos enumerar diferentes aspectos revisables para el diagnstico de una
mala imagen:
Verificar que la iluminacin sea la correcta.
Verificar que las lentes del objetivo estn limpias.
Comprobar que entre el diafragma de campo y el de abertura, no haya
ningn filtro difusor.
El centrado del revlver porta objetivos debe ser el correcto.
El portaobjetos y el cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que el
primero est bien colocado, y que no haya dos cubreobjetos
superpuestos.
Verificar la limpieza de todo el sistema ptico. Esto se puede efectuar
haciendo girar por separado los oculares que el microscopio posea,
comprobando si las pequeas motas de suciedad se mueven Si es as, es
que hay que limpiar el ocular.
Luego, habr que hacer girar el tubo ocular en su conjunto; ste no debe
ser desmontado nunca, pero s se pueden limpiar cuidadosamente los
prismas soplando sobre las superficies accesibles. El objetivo puede
limpiarse desenroscndolo ligeramente y ayudndose de un pincel seco.
 POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN.
Comprobar que el aceite de inmersin sea el suficiente, sin burbujas ni
impurezas, y que no sea fluorescente.
Asegurarse de que el objetivo est bien enroscado.
Verificar el grosor del cubreobjetos, portaobjetos y medio de montaje, que
es decisivo, sobre todo en medianos y grandes aumentos. Es importante,
igualmente, no colocar dos cubreobjetos superpuestos.
La montura del condensador debe estar bien centrada y la frontal bien
sujeta, en el caso de que sea abatible. Comprobar que la cremallera est
bien apretada, para mantener la posicin.
La intensidad lumnica no debe ser dbil, ni excesiva. No hay que regularla
nunca con el diafragma del condensador.
Tener cuidado de no utilizar objetivos de contraste de fases para
observaciones de campo claro, sobre todo cuando trabajamos con grandes
aumentos.
Si el microscopio tiene espejo, es necesario comprobar que la cara plana
sea la que proyecte el haz luminoso sobre el diafragma del condensador.
 POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN.

Utilizar una combinacin correcta entre el ocular y el objetivo, pues

puede ocurrir que el ocular sea demasiado potente.
Comprobar que la preparacin est bien hecha, comparndola con
una preparacin test.
En contraste de fases, es comn el error en el centrado del anillo de
iluminacin.
Aunque ste puede descentrarse debido a la geometra de las
estructuras.
En observaciones con fluorescencia, las fluorescencias parsitas que
se pueden descubrir pueden ser debidas a: el medio de montaje, al
aceite de inmersin, una ptica inadecuada, el uso de un filtro
incapaz de cortar los rayos de excitacin.
Si el medio de montaje tiene un ndice de refraccin muy similar al
del objeto incoloro, ste no podr verse, ni con contraste de fases,
ni con contraste interferencial.
MICROSCOPIO
ELECTRNICO
 Desde Fotones a Electrones
Algunas similitudes
Similares propiedades pticas
difraccin, aberracin, astigmatismo, etc
Resolucin espacial depende de la longitud de onda
Para energas mas altas menor longitud de onda
Voltajes tpicos de aceleracin de electrones
Microscopia de barrido (SEM) 1 30 kV
Microscopa de trasmisin (TEM) 40 1200 kV

Microscopios pticos Microscopio electrnico

Longitud de onda 200 700 nm l=0.1-0.002 nm

(1-100 kV)

Resolucin espacial ~ 1 m ~ 1 nm

Mxima Mag 1.000 x 1.000.000 x

Modo de operacin Luz reflejada / trasmitida, SEM,

TEM

muestras Puede contener agua Compatible con vaco

 Del ojo al microscopio Electrnico

Resolucin Magnificacin

Ojo humano 0,2 mm 1X

Microsc. ptico 0,2 m=0,0002 mm 1.000-2.000 X

Microsc. de barrido 2 nm=0,000002 mm 1.000.000 X

Microsc. de 0,1 nm =0,0000001 mm 30.000.000 X

transmisin
 Profundidad de foco
Microscopio ptico Microscopio Electrnico
Imagen de una oruga obtenida con un detector de electrones retrodifundidos
de 4 cuadrantes (QBSD),a una presin de 15 Pa, 25 keV, La muestra fue
colocada sobre una platina fria a - 25C
 Hasta donde podemos ver
Desde 100X hasta 70kX

Mag = 120x Mag = 500x Mag = 3.500x

Mag = 6.000x Mag = 25.000x Mag = 70.000x

 EL MICROSCOPIO ELECTRNICO
la luz se sustituye por un haz de electrones
que pasan por un tubo (con vaco para
mejorar el paso de los electrones).
Aumenta la imagen con lentes
magnticas.
Aumenta las imgenes hasta un milln de
veces.
Las imgenes que se producen son en
blanco y negro y muchas veces tienen
colores falsos.
Oculares. Lentes a travs de las que
se observa la preparacin ampliada
(externos).

Objetivos. Lentes que aumentan el

tamao de la imagen (internos).

Iluminacin. Can de electrones que

genera un haz que puede atravesar la
muestra o rebotar en ella (interno).
 EL MICROSCOPIO ELECTRNICO

Los objetos inferiores a 0,2 m, como los virus o las estructuras

internas celulares, deben observarse con un microscopio
electrnico.
Su poder de resolucin es mucho mayor que el de los otros
microscopios citados debido a que la lentitud de onda de los
electrones es alrededor de 100.000 veces menor que la de la luz
visible.
Los electrones libres viajan formando ondas, exactamente igual
que la luz. En lugar de lentes de vidrio el microscopio electrnico
utiliza lentes electromagnticas para enfocar un haz de electrones a
travs de un tubo, en el que se ha hecho el vaco, sobre la muestra.

Hay dos tipos de microscopios electrnicos:

los microscopios electrnicos de transmisin
los microscopios electrnicos de barrido.
 MICROSCOPIO ELECTRNICO

Los electrones chocan con

la muestra y se desvan, y
estas desviaciones son
recogidas por la pantalla.
Observamos la imagen a
travs de una pantalla que
es excitada por los
electrones que llegan a
ella (mecanismo similar a
la televisin).
Las imgenes se recogen
en una placa fotogrfica
que es impresionada
directamente por los
electrones.
 EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN(MET)
Un MET mira a replicas de clulas
muertas , despus de haber sido
fijadas y teidas con iones de
metales pesados.
Los electrones son dispersados
cuando pasan a travs del
espcimen, y luego detectados y
proyectados hacia una
imagen sobre una pantalla
fluorescente.
El microscopio electrnico de
transmisin (MET) tiene un limite
de resolucin de cerca de 0.1 nm.
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE
TRANSMISIN
UNIDAD

IMGENES EN EL MET
1
Slo permite observar clulas muertas, pero la ventaja es
que permite estudiar las estructuras internas de los
orgnulos celulares.

En este caso las muestras deben

ser muy finas para que puedan ser
atravesadas por los electrones y
tienen que estar deshidratadas.
Se observan objetos de 0.1 nm.
 EL MICROSCOPIO
ELECTRNICO DE BARRIDO
(MEB) (SEM)

Al igual que el MET, el MEB

permite mirar a clulas muertas,
despus de haber sido fijadas y
teidas con iones de metales
pesados.
Con esta tcnica los electrones
son reflectados sobre la
superficie del espcimen.
Sirve para examinar la
superficie de los objetos y
muestra la forma real de los
objetos.
-Pueden observarse objetos de 2 nm.
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB) (SEM)
En la microscopia electrnica de barrido un can de
electrones proporciona una haz de electrones enfocado con
precisin, llamado haz primario.

Estos electrones atraviesan lentes electromagnticas y son

dirigidos sobre la superficie de la muestra.

El haz primario de electrones arranca nuevos electrones de la

superficie de la muestra y estos electrones secundarios son
transmitidos hasta un colector de electrones, amplificados y
utilizados para formar una imagen sobre una pantalla o sobre
una placa fotogrfica.

El microscopio electrnico de barrido es especialmente til en

el estudio de estructuras superficiales de clulas intactas y virus.
EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB) (SEM)

En el microscopio electrnico de barrido (MEB) o microscopia

de exploracin electrnica (SEM), los electrones inciden desde
arriba sobre la preparacin, por ello la muestra puede ser de
cualquier grosor o tamao.

Emplea dos tcnicas preparatorias:

a) Secado por congelacin.
b) Secado por punto crtico.
Despus se cubre la muestra con una capa de metal (oro o
platino).

El microscopio electrnico de barrido no tiene la resolucin que

se alcanza con el microscopio electrnico de transmisin, pero
su ventaja es una excelente impresin tridimensional
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO
 Galera
de
Imgenes
Pan; Detector-VPSE, 40 Pa, 20 keV
Madera; Detector - QBSD, 25 Pa, 25 keV, 0C
Arcilla; Detector - QBSD, 30 Pa, 20 keV
Cemento; Detector - VPSE, 40 Pa, 20 keV
Piedra Calisa; Detector - VPSE, 40 Pa, 20 keV
Ceramico-fractura; Detector - VPSE, 3 keV, 20 Pa aire
Producto de Corrosion: VPSE, 20 keV, 65 Pa agua
Fibras de Vidrio; Detector - SE, HV, 20 keV
Dendritas de plata; Detector - SE, HV, 20 keV
Arena; Detector - QBSD, 80 Pa, 20 keV
Ceniza - Volcanica; Detector - QBSD, 60 Pa, 20 keV
Nanotubo de Carbono, Detector SE, 3 kV
GRACIASS