El ecosistema ruminal, mtodos

de estudio y aplicaciones

Nestor E. Obispo. Ph.D.

E-mail: nobispo@gmail.com
 Por qu nos interesa el rumen?

Generar conocimientos sobre el ecosistema

Manipulacin del ecosistema ruiminal
Mejorar la productividad
Disminuir el impacto ambiental

Dificultades

El ecosistema es complicado per se.

Falta de conocimientos sobre la diversidad de las
poblaciones microbianas del rumen.
y de los mtodos adecuados a travs de los cuales se
puedan evaluar los cambios microbianos.
 Los rumiantes y el hombre
1,38 x 109 bovinos
1,19 x 109 ovinos, caprinos
2,21 x 108 bufalinos, camlidos
(FAO, 2009)

La carne, leche y otros bienes obtenidos de los rumiantes son productos

agrcolas importantes importantes para los seres humanos.
La produccin agrcola con rumiantes tiene un valor econmico
considerable y sustenta la seguridad alimentaria en muchas regiones del
mundo.
Sin embargo, el sector se enfrenta a grandes desafos debido a la
disminucin de los recursos naturales y el consiguiente aumento de los
costos de produccin, as como problemas de impacto ambiental que
genera esta actividad.
 Hay una gran variedad de microbios en el rumen.
El ecosistema ruminal controla la nutricin
energtica y proteica del rumiante.
A travs de procesos enzimticos, los microbios
descomponen los compuestos celulsicos,
amilsicos y nitrogenados de la dieta y los
convierten en subproductos y clulas bacterianas
utilizables por el animal.
Algunos de los productos de la fermentacin
pueden ser absorbidos directamente a travs de la
pared ruminal o pueden pasar al tracto intestinal
inferior, donde son absorbidos directamente o ms
digeridos antes de su absorcin.
Importancia de los microbios del rumen

5
 El aumento de la produccin de microbios en
el rumen es una parte clave para elevar la
produccin y la composicin de la leche.
Los microbios descomponen los alimentos
para producir cidos grasos voltiles, que son
utilizados por el animal como energa.
Los microbios del rumen tambin son
digeridos y absorbidos en el intestino delgado
del rumiante y es fuente una de protena
para la produccin de leche, proporcionando
una buena parte de las necesidades del
animal.
Los diferentes microbios tienen diferentes
funciones digestivas. Hongos, bacterias y
protozoos son los tres tipos diferentes de
microbios del rumen ms estudiados
 Evolucin de los vertebrados
Falla en el desarrollo de las enzimas para
hidrolizar los enlaces -1,4 de los
carbohidratos estructurales que forman la
fibra vegetal.
Desarrollo de relaciones simbiticas entre
el animal y los microorganismos anaerobios
(bacterias, protozoarios y hongos) del
rumen.

7
Fermentadores

Postgstricos Ciego Colon

chigire caballo
conejo rinoceronte
tapir elefante

Pregstricos Rumen
bovino
ovino
caprino
crvidos
camlidos
jirfidos

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Fermentadores Pregstricos
Los animales con fermentacin pregstrica
derivan ventajas de la relacin simbitica:
Celulosa y otros polisacridos son
hidrolizados a compuestos de menor tamao
que son importantes fuentes de energa para
el hospedero;
Reducen moderadamente el volumen de la
MS que ha de pasar al tracto posterior;
Sintetizan vitaminas complejo B y K;
Los cuerpos de los microbios son fuentes de
protena para el hospedero.

9
El ms grande espacio de fermentacin
animal en el mundo

Aproximadamente 1,3 billones de

cabezas bovinas
Bacterias 1010 a 1012 cells/mL
Volumen del Rumen desde menos de
1L en el Blue Duiker a 200L en una
vaca 10
11
Reduccon del tamao de particula

El msticado al comer (mnima)

Preparacin para el tragado;
Liberacin de los constituyentes solubles;
Las particulas vegetales que se han daado
durante la masticacin, son areas para la
adhesin microbiana.
La msticado durante la rumia (extensiva)
Disminucin del tamao de la particula para el
pasaje por el orificio reticulo-omasal;
Ms dao de la particula vegetal para la
adherencia de los microorganismos.
Digestin microbiana (Fermentacin);
Contracciones ruminales.
12
El ambiente ruminal

13
El ambiente ruminal

Condicin ambiental casi constante dentro

de ciertos limites, e ideal para el
desarrollo de microorganismos anaerobios.
Capacidad:
3 - 15L oveja
35 - 200L vaca

Temperatura: 38 - 40 C
Los protozoarios no sobreviven a
temperaturas superiores a los 40 C por
perodos prolongados.

14
El ambiente ruminal

pH: 5,5 - 7 (en las llamadas dietas normales)

Limites extremos: 4,5 - 7,5;
Los protozoarios son ms sensibles que las bacterias
celulolticas, desaparecen si sube a 7,8, o baja
alrededor de 5;
Bacterias celulolticas descienden en nmero a 6,5 y
son eliminadas a 5,9;
Es el factor ms variable;
Depende de la naturaleza de la dieta, frecuencia de
alimentacin;
Es un reflejo de la cantidad de cido producido por la
accin microbiana sobre los sustratos, y es mediado por
la absorcin y la capacidad tampn de la saliva.
15
El ambiente ruminal

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El ambiente ruminal

Presin osmtica:
El licor ruminal es hipotnico con respecto al plasma
Licor ruminal: 250 mOsm Kg-1
Plasma: 300 mOsm Kg-1

Materia seca:
10 - 13%

Tensin superficial:
45 - 59 dinas cm-1

Gases: CO2 (65%), CH4 (27%), H2 (0,2%), H2S (trazas), CO

(trazas) N2 (7%), O2 (pequeas cantidades transitorias).
17
El ambiente ruminal

Potencial redox (Eh): -150 a -350 mV (Clark,

1977)

Muchas sustancias reductoras estn asociadas a las

partculas y al material en estado coloidal y no a
las bacterias;
Los anaerobios facultativos remueven el oxigeno o
lo reducen;
Los forrajes tienen Eh ms bajo que los
concentrados.

18
Microorganismos del rumen

19
Alimente los microbios del rumen, ellos alimentan a la vaca
Alimento
Ingerido
AGV
Protena Microbiana
Vitaminas

Los nutrientes del alimento ingerido,

una vez fermentados, resultan en
compuestos diferentes
21
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23
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 En general, el destino final de los carbohidratos es su
conversin a energa para el rumen y el animal

GASES
Pared Celular Celulosa
(Fibra) Hemicelulosa
Lignina Actico
Propinico
RUMEN Butrico
Azucares
Almidn
SNTESIS
MICROBIANA

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26
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28
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30
 En general, la racin normal de los rumiantes
contiene bajos niveles de grasa (3%);
La mayora son Galactolpidos, triglicridos que
contienen AG poliinsaturados;
En el rumen se producen modificaciones de esos
AG, los cuales no son fermentados, excepto el
glicerol y los carbohidratos presentes;
Los AG insaturados son txicos para los
microorganismos del rumen;
Razn por lo cual son saturados previa hidrlisis del
triglicrido o del galactolpido;
La hidrlisis es un prerrequisito para que ocurra la
saturacin;
Cuando el pH del rumen es cido <5,5 se inhiben
las lipasas microbianas y no ocurre la hidrlisis.

31
32
Protozoarios

Observados por Gruby y Delafond (1843).

Clasificacin:
Basada mayormente en caractersticas
morfolgicas;
Tamao poblacin: 106 organismos mL-1;
Mayormente ciliados (algunos flagelados);
Varan en tamao (15 - 20 m ancho por 10 - 200
m largo).

33
34
Protozoarios

Fermentan constituyentes de las plantas, Isotrichidos,

carbohidratos solubles, Entodiniomrfos, solubles y
celulosa;
Se reproducen por fisin binaria, pero
actividades de conjugacin se dan en el genero
Dasytricha (Warner, 1966);

Exposicin con un adulto faunado, permite el

pase de un animal a otro por la saliva. Tambin
se sugiere la va aerosol;

Son depredadores (entre ellos y de bacterias);

Dificultades para cultivarlos in vitro en medios

purificados (bacterias en los cultivos).

35
Los hongos anarobios

Warner (1966) observ que el protozoario

flagelado Callimastix frontalis incrementaba en
nmero dramticamente despus la alimentacin
del animal y luego disminua 10h despus;
Orpin (1974) investig estas variaciones en el
organismo, observando que estaba asociado a las
grandes partculas del alimento y sugiri que era
all donde se secuestraba el flagelado;
Orpin (1975) logr el aislamiento, del N. frontalis,
revelando su ciclo de vida y luego identificndolo
como un hongo anaerobio.

36
Los hongos anarobios

37
 Los hongos anarobios

Nmero 102 -106 UFC

Fermentan los sustratos ms recalcitrantes

Generos
Neocallimastix
Caecomyces (anteriomente Sphaeromonas)
Piromyces (anteriormente Piromonas)
Orpinomyces
Ruminomyces
Anaeromyces
Cyllamyces
(Chen et al., 2007)

38
Bacterias

39
 Bacterias The rumen and Its Microbes (Hungate, 1966)
Pocos progresos:
Primeros experimentos, von
Tappeiner (1984 1940);
Baker y Harris (1947)
observan cocos que degradan
la celulosa en el rumen;
Hungate (1947) aisla cultivos
puros varias bacterias
celulolticas aisladas del
rumen bovino;
Sijpestein (1948, 1951)
Holanda, crecimiento de
bacterias celulolticas y
aislamientos de cepas puras;
Marston (1948) Inglaterra,
estudios in vitro con cultivos
mixtos de bacterias ruminales.
Rpidos avances:
Hungate y sus alumnos,
desarrollan y modifican tcnicas
anaerbicas y determinan las
bacterias anaerbicas que ms
ocurren en el rumen (Hungate
1950, Bryant y Burkey 1953).
El futuro es ms promisorio
Las tcnicas moleculares
abren nuevos caminos para la
investigacin del rumen.
40
Ecuacin de Nermst

Hungate (1969) calcul la concentracin de O2

necesaria para desarrollar en un medio de cultivo
un Eh de -0,33V (crecimiento de metanognicos), a
este potencial el medio contiene 1,48 x 10-56
moleculas de O2 L-1

Dificultad de obtener bajos Eh;

La cantidad de O2 permisible disuelto en solucin
en el medio de cultivo, llega a ser una funcin
estadstica de un nmero finito de molculas;
Es muy cuesta arriba (imposible) la obtencin de
un bajo Eh simplemente por la remocin del O2;
Para obtener el Eh ms bajo, hay que aadir un
sistema reductor con un potencial ms bajo.
41
 Dificultad

Desarrollar medios de cultivo con las

caractersticas del ambiente ruminal

Condicin anaerbica;
Potencial Eh;
Osmolaridad;
Factores de crecimiento microbiano;
pH;
entre otros.

42
Trampa para Oxigeno Gas libre de O2

Tapn de silicn

2Cu + O2 Cu2O (+1)

300C

Cable (Cromel 21) Conectado a la Cu2O + H2 Cu + H2O

corriente elctrica de 110V (genera
calor en la columna para acelerar
reaccin oxido-reduccin del cobre 300C

Tapn de
silicn

Gas con O2

43
Preparacin de animales fistulados al rumen

44
 Cmo saber si una bacteria es del
rumen? Dr. Bryant (1959)
El organismo puede vivir en el ambiente;
El nmero de una especie dada que ocurre en el
rumen, es considerablemente superior a su nmero
en el alimento o en el agua;
Utiliza los sustratos presentes en el rumen o en el
alimento (celulosa, hemicelulosa, pectina,
almidn, entre otros);
Los productos finales de la fermentacin son
compatibles con los presentes o fcilmente
metabolizados en el rumen;
Las condiciones para su cultivo, pH, Eh,
temperatura y requerimientos nutricionales
similares con las halladas en el rumen;
Repetidos aislamientos de una especie particular
sobre un perodo de tiempo, en diferentes
huspedes, en varios lugares, son buenas
evidencias. 45
 Poblacin 1011 cel mL-1 de contenido ruminal
Celulolticos Hemicelulolticas
Ruminococcus flavefaciens Butyrivibrio fibrosolvens
Ruminococcus albus Prevotella ruminicola
Fibrobacter succinogenes Fibrobacter succinogenes
(Bacteroides succinogenes) Ruminococcus flavefaciens c-94
Eubacterium cellulosolvens Rumincoccus albus 7
Butyrivibrio fibrosolvens

Amilolticas
Pectinolticas Streptococcus bovis
Butyrivibrio fibrosolvens Ruminobacter amylophilus
Prevotella ruminicola Succinimonas amylolytica
Lachnospira multiparus Selenomonas ruminantium
Succinivibrio dextrinosolvens Succinivibrio dextrinosolvens
Fibrobacter succinogenes Eubacterium ruminantium

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47
Bacterias utilizadoras de otros substratos:
Lactato: Veillonela alcalescens, Megaesphaera elsdenii.
Bacterias metanognicas (arquoebacterias):
Methanobrevibacter ruminantium, Methanomicrobium
mobile, Metanosarcina barkeri y Methanobacterium
formicicum.
Productores de cido lctico:
Lactobacillus lactis, L. vitulinus y L. ruminis.
Bacterias proteolticas:
Ruminobacter amylophilus, Prevotella ruminicola,
Selenomonas ruminantium, Butyrivibrio fibrosolvens,
Butyrivibrio akacticidigens.

48
Mtodos de cultivo
in vitro: fermentacin con contenido ruminal
completo:
Esttico o sistema cerrado;
Sistemas continuos se intenta mantener
condiciones estables (RUSITEC).
Cultivos puros: Envuelve el aislamiento de una cepa
de bacteria y su subsecuente caracterizacin (slo
da informacin de un organismo).
Cultivos mixtos: (Da informacin sobre actividades
competitivas, sinergisticas, entre otras).
in vivo in vitro: La llamada tcnica vivar (Fina
et al., 1958; 1962);
in situ: tcnica de la bolsa de nylon (Hopson et
al., 1963; Johnson, 1966).

49
Cultivos puros:
Descripcin de las especies aisladas: celulolticas, amilolticas,
proteolticas y otras;
Uso de gases (CO2, N2) libres de O2;
Los contenedores de los cultivos son sellados con tapones de
caucho;
El medio de cultivo que intente reproducir el del ambiente
ruminal, contiene: 40% de licor ruminal, minerales, resazurina
(indicador), cistena (agente reductor), bajo presin de CO2,
libre de O2, sustratos.

50
Fermentacin in vitro:
Celulolticos requieren poca cantidad de protenas o amninocidos,
usan amonio o urea.
Factores de crecimiento de los celulolticos entre otros, el Ac.
Valerico, PABA, Isobutirico, Isovalerico.
Estado de madurez y liginificacin del forraje afecta la actividad
degradativa, incluyendo las diferencias entre la pared celular de
leguminosas y gramneas.

Soluciones anaerobias para las diluciones;

Los tubos rodados de Hungate (Roll tubes);
Caldos de cultivo anaerobios;
Mtodos de conteo basados en la probabilidad
estadstica (NMP).

51
Contribucin de las tcnicas in vitro:
Estudios sobre la biohidrogenacin de los cidos
grasos (Wilde y Dawson, 1966);
Metabolismo del cido ctrico (Wright, 1971);
Hidrlisis del Biuret (Bauriedel, 1971; Bauriedel
et al., 1971);
Degradacin y efectos del oxalato (James et al.,
1967);
Efectos de la cristalinidad de la celulosa sobre su
digestibilidad (Baker et al., 1959);
Fijacin de N en el rumen (Jones y Tomas, 1974);
Efectos de las grasas en la degradacin de la fibra
(Jenkins y Palmquist, 1982);
Degradacin de varios compuestos de lignina
(Chen et al., 1985).

52
53
54
Determinacin del valor nutritivo del alimento

El valor nutritivo de los alimentos de los rumiantes es

determinado, principalemente por su digestibilidad;
Las tcnicas de digestibilidad in vivo, no son adecuadas para estas
determinaciones a nivel de un laboratorio;
Las tcnicas in vitro permiten simular la actividad fermentativa en
el rumen.

Tiley y Terry (1963)

Produccin de Gas in vitro
Rusitec

55
Tcnicas de produccin de gas
Permite determinar la extensin y la
cintica de degradacin del alimento a
travs del volumen de gas producido durante
el proceso fermentativo (Theodorou et al
1994).

Sistemas continuos de cultivo:

RUSITEC

56
 Qu balance tenemos del aporte de la
microbiologa anaerobia en el estudio del
ecosistema ruminal?
El actual estado de arte de la alimentacin y
nutricin de los rumiantes se soporta en casi su
totalidad en los estudios del ecosistema ruminal, un
ejemplo son las manipulaciones alimenticias del
animal;
Basado en las dificultades para aislar y cultivar los
organismos presentes en el rumen, quedan muchas
interrogantes sobre si se han aislado todas las que
son o no;
Las metodologas emergentes abren nuevas
posibilidades para aclarar muchas interrogantes.
57
 Reacciones tpicas que generan metano

4 H2 + CO2 CH4 + 2 H2O

4 formato CH4 + 3 CO2 + 2 H2O
4 2-propanol + CO2 CH4 + 4 acetona + 2 H2O
2 etanol + CO2 CH4 + 2 acetato
Metanol + H2 CH4 + H2O
4metanol 3 CH4 + CO2 + 2 H2O
acetato CH4 + CO2
59
60
61
El futuro de la microbiologa del rumen

63
 Uso de la biologa molecular en la identificacin
de los protozoarios del rumen

Regensbogenova et al, 2004 (Acta Protozool, 43: 219 - 224)

64
APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUES TO ASSESS CHANGES
IN RUMINAL MICROBIAL POPULATIONS AND PROTOZOAL
GENERATION TIME IN COWS AND CONTINUOUS CULTURE

Sanjay Kumar R Karnati,

Tesis de Doctorado OSU
2006.

65
 El estado de arte
Los avances en las tecnologas de secuenciacin del
ADN y la bioinformtica estn transformando nuestra
comprensin de los ecosistemas microbianos complejos,
incluyendo el tracto gastrointestinal de los mamferos.
La aplicacin de estas tcnicas al ecosistema del rumen
ha permitido el estudio de la diversidad microbiana bajo
diferentes condiciones de alimentacin y produccin.
La secuenciacin de genomas de varias especies de
bacterias y archae del rumen cultivadas proporciona
informacin detallada sobre su fisiologa.
La metagenmica, destinada principalmente a
comprender la maquinaria enzimtica implicada en la
degradacin de los polisacridos estructurales
vegetales, est comenzando a producir nuevos
conocimientos, permitiendo el acceso a la comunidad
total y eludiendo las limitaciones impuestas por el cultivo
in vitro.
66
 Esto permitir caracterizar la estructura de la microbiota
ruminal y su vinculacin con las funciones que
El estado de arte
desempean uno o grupo de organismos en el
ecosistema.
Los resultados iniciales sealan que la microbiota ruminal
es mucho ms compleja de lo que nos imaginamos.
La catalogacin de sus genes requerir un considerable
procesos de secuenciacin y bioinformtica. La
construccin de un catlogo de genes microbianos
ruminales a travs de la metagenmica y la secuenciacin
genmica son metas alcanzables.
Un catlogo de genes de la microbiota ruminal es
necesario para comprender la funcin del microbioma y su
interaccin con el animal y los alimentos.
Lo anterior ser la base para modelos de microbioma-
huesped integradores para modelos estratgicos que
promuevan rumiantes menos contaminantes, ms
robustos y eficientes. 67
 Manipulacin del rumen

Los protozoarios son depredadores de

microorganismos;
Contribuyen poco a la economa del
husped;
Su eliminacin incrementa la
produccin de PM y mejora perfiles
fermentativos.

68
Una vaca produce al
ao entre 45-100 kg
de gas metano
X Rebao Nacional

Cambios en la alimentacin
Vacunas anti-metanognicos
Alternativas ???? Eliminacin de protozoarios

69
70
Aceites de maz y de coco como desfaunantes en
el rumen de ovinos mantenidos en aislamiento

71
Totales: 2,7x
Celulolticas: 1,14x

72
73
 Actividad para completar este capitulo del curso
Mximo dos cuartillas

1. Cree usted que hay necesidad de estudiar las

caractersticas de la microbiota ruminal y por qu?
2. Describa al menos cinco aportes para la produccin
con rumiantes que se hayan basados en los estudios
de la microbiologa ruminal?
3. Cmo podran los estudios de la metagenmica de
este rgano mejorar la produccin y mitigar el impacto
al medio ambiente de la actividad ganadera?
74
GRACIAS