Purificacin de protenas

Purificacin

Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la

concentracin diferencial de la protena o molcula de inters
 Condiciones generales a evaluar

Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a mis

objetivos)
secuenciacin, cristalizacin
ensayo de actividad, productos alimenticios mdicos
nativa?
Cantidad tcnicas de alta capacidad y de baja capacidad
preparativas
analticas
Costos
 Pasos a seguir en una purificacin

1. Definir un ensayo especfico que identifique a la protena (actividad

biolgica) (especfico, sensible, rpido y barato)
2. Elegir la fuente (matriz biolgica)
3. Extraer la protena de la fuente (protenas intraceluares o
extracelulares)
4. Estabilizacin de la molcula
5. Aislamiento y concentracin (fraccionamiento)
6. Determinar la pureza y calidad del producto final
 1 Actividad Biolgica

Cantidad de protena que produce, por su accin biolgica, un determinado cambio.

Este cambio puede ser:

Un efecto biolgico (Muerte celular, hemlisis, proteccin inmunolgica)
Variacin en la cantidad de una sustancia qumica (producto de una reaccin)
De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biolgica como :

Una unidad de Actividad Biolgica es la cantidad de protena que produce una

determinada cantidad de efecto

1. Toxina
Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de protena que produce la
muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones)
2. Enzima
Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de protena que produce 5.98
moles de producto en 1 minuto en condiciones (siguen especificaciones)
 2 Eleccin de la Fuente

Matriz donde se encuentra la protena de inters

Concentracin
Accesibilidad
Costo
Facilidad de la extraccin
 3 Extraccin de la protena de la fuente

Lisis osmtica: tcnica muy suave. Uso de sn hipotnicas + fuerzas

mecnicas. Para bacterias y clulas vegetales: lisozimas u otras enzimas

Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas

Ultrasonido: sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra

 4 Estabilizacin

Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento

1 PH
2 Grado de oxidacin (-SH)
3 Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes
4 Polaridad y fuerza inica de la solucin
5 Presencia de proteasas
6 Temperatura
5 Actividad de la molcula
 5 Aislamiento y concentracin
Fraccionamiento del extracto crudo

Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan

propiedades fisicoqumicas o biolgicas de la protena de inters
para separarla del resto de las molculas
Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el
rendimiento en la purificacin, pureza y actividad especfica de cada
fraccin obtenida.
Si bien no hay una sola secuencia de tcnicas a seguir, en general
se recomienda empezar por tcnicas de alta capacidad y seguir con
las de baja capacidad.
En general se desea obtener una gran pureza (segn los
objetivos) acompaada de un gran rendimiento.
 Solubilidad diferencial
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de absorcin
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa de afinidad
Electroforesis
Isoelectroenfoque

Resolucin Capacidad
 Monitoreo del proceso de fraccionado

Actividad Especfica AE = Unidades totales en la fraccin i

Total de protenas en la fraccin i

Rendimiento R = Unidades totales en la fraccin i

Unidades totales en la fraccin original

Porcentaje de purificacin P = AE en la fraccin i

AE en la fraccin original
Actividad vs Actividad especfica
 1800 110
AE
1600
Purificacin 100
1400 Rendimiento

90
1200
AE y Purificacion

1000 80

Rendimiento
50
70

40
60
30
50
20

40
10

0 30
1 2 3 4 5 6

pasos
 2600 100
Actividad total
2400 Actividad por mililitro

2200 80

2000

Actividad por mililitro

Actividad Total

1800 60

1600

1400 40

1200

1000 20

800

600 0
0 1 2 3 4 5 6

XPasos
Data
 Fraccionamiento por desnaturalizacin
(precipitacin diferencial)

Temperatura
 PH: PI

Salting-in
Fuerza inica

( I = 0.5 miZi2)
Salting-out: Sultafo de amonio
Fosfato de potasio

Formas de obtener la precipitacin

- en forma de producto seco
-en forma de sn saturada de la sal

Tanto si se trabaja con el precipitado o con el sobrenadante esta tcnica en

general va seguida de una tcnica de de-salado
Maxima solubilidad=497 g/L a 32 grados centigrados
G = Sat(M2-M1)/(SatM-(SpecVol/1000*132.14*SatM*M2))

In which G = the weight of Ammonium Sulfate to add in grams per liter,

Sat is the number of grams/Liter in a saturated solution of Ammonium
Sulfate, M2 = the molarity you want to achieve, M1 = the starting
molarity, SatM is the molarity of a saturated solution of Ammonium
Sulfate. SpecVol is the specific volume of Ammonium Sulfate, which is
the amount of volume 1g will add to an aqueous solution, which is
about 0.54 mls
 Uso de solventes orgnicos: modifican D (constante dielctrica) e
hidratacin
Etanol
Acetona
butanol
Producen algo de desnaturalizacin. Requieren de bajas temperaturas