PCR

1. Scopul PCR
2. Generalitati
3. Reactia PCR
4. Factorii variabili
• Temperatura
• Numarul si durata ciclurilor de amplificare
• Primeri
• Tampoane
• Polimeraza
 Polymerase Chain Reaction
• “Amplifica” mari cantitati de ADN (μg) din cantitati extrem de mici (fg) de
ADN
• Permite analiza unor fragmente unice de ADN din amestecuri extrem de
complexe de ADN
• Permite modificarea secventei ADN prin mutageneza directa situs-specifica.
 Generalitati
1. Ciclurile de
temperatura

Denaturare 94°
Imperechere 55°
Amplificare 72°

2. La fiecare ciclu, ADN-ul

aflat intre primeri este
amplificat
Amplificarea PCR
Amplificarea exponentiala

30 cicluri - 1 miliard de copii (teoretic)

 Componentele reactiei PCR
• ADN matrita
• Primeri care flancheaza matrita
• Polimeraza termo-stabila
– Taq Polimeraza
• dNTP Thermus aquaticus
– (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• Tampon PCR (Mg++)
• Thermocyler
 Variabile in reactia PCR
1. Temperatura
2. Numarul si temperatura de desfasurare a
ciclurilor
3. Primerii
4. Tamponul
5. Polimeraza
 Temperatura
• Denaturarea
– Tine cont de intervalul extrem de redus de temperatura in care
polimeraza se poate denatura
• Taq se inactiveaza in 40min la 95 ° si in 10min la 97.5°
– 95°

• Imperecherea (annealing)
– Vizeaza obtinerea unei imperecheri eficiente si specifice
– 55o

• Extinderea (polimerizarea)
– La temperatura optima de lucru a Taq polimerazei
– 72°
Durata si temperatura ciclurilor
Situatia tipica
Pasul Timp/Temperatura
1 3 min la 95°
2 30 sec la 95°
3 1 min la 55°
4 2 min la 72°
5 Repetare de la ciclul 2 - 29 ori
6 8 min 72°
7 0 min 4°
8 final
 Primeri
• Perechi de primeri are flancheaza
secventa de amplificat
• Lungimea (17-28 pb)
• Continutul GC 50-60%
• De evitat secventele simple – ex. catene
formate prin polimerizarea unei unice nucleotide
• De evitat secvente auto-complementare
(care pot forma bucle, structuri de tip,
homodimerii, heterodimerii)
 Tamponul PCR
• Componentele de baza
– 20mM Tris-HCL pH 8.4
– 50mM KCl
– 1.5 mM MgCl2
• Magneziu – deoarece ionii de Mg formeaza complexe cu dNTPs, primerii si
matrita ADN, concentratia optima de MgCl2 trebuie aleasa pentru fiecare
experiment. Concentratia prea scazuta de Mg2+ produce o scadere a
cantitatii de produsi PCR obtinuti, iar o concentratie prea mare duce la
amplificari nespecifice si erori de incorporare a nucleotidelor.
• Aditivi optionali
– Destabilizatori ai helixului – utili cand ADN-ul tinta are un continut ridicat de
G+C.
• dimetil sulfoxide (DMSO),
• dimethil formamida (DMF),
• uree
• formamida
– In cazul unor matrite de dimensiuni foarte mari >1kb. Formamida si glicerol
– Cand concentratia matritei este scazuta: polietilen glicol (PEG)
 Polimerazele
• Taq, Vent, Pfu, altele
• Native sau clonate
• Timp de inactivare
– Ex. Taq 40 min, Vent 7 ore
• Activitate 3’-5’ exonucleazica – proofreading
• Rata de eroare
– Taq 1/10.000 nucleotide, Pfu 1/1.000.000
• Eficienta in polimerizare
 Note
• Reactie PCR tipica (exemplu)
• 32.5 μl H2O distilata
• 5 μl 10 x tampon PCR + MgCl2
• 1 μl 200 μM dNTP
• 0.5 μl 50 μM Primer stanga
• 0.5 μl 50 μM Primer dreapta
• 10 μl lizat drosophila
• 0.5 μl Taq Pol (5 unitati / μl)
50 μl Volum total
 Master Mix
• 1 volum master mix
– 32.5 μl dH2O
– 5 μl 10 X PCR buffer
– 1 μl 200 μM dNTP
– 0.5 μl Taq Pol (5 Unitati / μl)
39 μl Volum Total

• Pentru 4 reactii se prepara 4.4 volume de reactie master mix

– 143 μl dH2O
– 22 μl 10 X PCR buffer
– 4.4 μl 200 μM dNTP
– 2.2 μl Taq Pol (5 unitati / μl)

• Reactiile individuale
- 39 μl master mix
- 0.5 μl primer stanga
- 0.5 μl primer dreapta
- 10 μl lizat drosophila
 TIPURI DE REACTIE PCR
PCR este o metoda extrem de versatila si a
putut fi modificata si adaptate la o larga gama
de aplicatii.
Inverse PCR
- In cadrul acestei aplicatii, amplificarea unei
secvente necunoscute se realizeaza plecand
de la o secventa cunoscuta.
- Este extrem de utila pentru identificarea
secventelor ce flancheaza diverse inserte
genomice.
  Anchored PCR

- o mica secventa nucleotidica

poate fi atasata la ADN-ul tinta, a
carui amplificare este vizata.

- Aceasta secventa (ancora) este

in mod frecvent poli G si este
amplificata utilizand primeri poli C.
  Reverse transcriptase PCR

- Este folosita pentru

amplificarea de molecule ARN.

- RT-PCR este larg utilizata in

studii de expresie genica,
pentru determinarea expresiei
unei gene sau pentru
identificarea secventei unui
transcript ARN.
  RACE PCR
-utilizata pentru obtinerea de secvente terminale 3' si 5' la
nivelul unui transcript cDNA.
 Quantitative real time PCR (Q-RT PCR)
Este folosita pentru amplificarea si detectia unei
probe ADN.
 Se bazeaza pe folosirea de coloranti specifici
pentru ADN
 Se bazeaza pe metoda probei fluorescente
reporter

- Detectia si cuantificarea reporterului fluorescent are

la baza cresterea semnalului florocromului , direct
proportional cu cresterea cantitatii de produsi de
reactie PCR
- Metoda nu cuantifica nivelul produsului final de
reactie ci chiar producerea acestuia, in timp real
- Probele TaqMan au o secventa care le permite sa se
cupleze in interiorul regiunii de ADN supusa amplificarii, cu
ajutorul unui set specific de primeri.

- In momentul in care Taq polimeraza extinde primerii,

gratie activitatii sale 5' - 3‘ exonucleazice, va degrada
probele cuplate la nivelul matritei.

- degradarea probelor va elibera fluorocromii, cu aparitia

unei fluorescente detectabile de catre sistemul de
inregistrare a aparatului.

- nivelul fluorescentei detectate in timpul Q-RT PCR este

direct proportionala cu cantitatea de fluorocromi
eliberata, deci cu cantitatea de matrita ADN prezenta in
mediul de reactie.
  PCR Asimetric
-este folosit pentru sinteza de ADNmc, util in
experimentele de secventiere
-primerii sunt introdusi in proportie de 100:1 astfel
incat, dupa 20-25 cicluri de amplificare unul dintre
primeri este epuizat , astfel incat in urmatoarele 5 –
10 cicluri se produc numai monocatene ADN.
 PCR alela-specific
- Este o amplificare PCR selectiva a unei alele
specifice care permite detectia polimorfismului la nivel
de o nucleotida (single nucleotide polymorphism-SNP)
-Amplificarea selectiva se realizeaza de regula, prin
folosirea de primeri care se pot imperechea sau nu cu
una dintre alele.
 Alte tipuri de PCR
Overlap extension PCR
 Assemble PCR
 Helicase dependent amplication
 Intersequence-specific PCR(ISSR)
 Ligation-mediated PCR
 Methylation –specific PCR
 Miniprimer PCR
 Multiplex PCR
 Nested PCR
 Solid phase PCR
 Touch down PCR si altele
 Parameter PCR Gene cloning
1. Final result Selective Selective amplification
amplification of of specific sequence
specific sequence

2. Manipulation In vitro In vitro and in vivo

3. Selectivity of the specific First step Last step

segment from complex
DNA

4. Quantity of starting Nanogram (ng) Microgram (m)

material
5. Biological reagents DNA polymerase Restriction enzymes,
required (Taq polymerase) Ligase, vector.
bacteria

6. Automation Yes No
7. Labour intensive No Yes
8. Error probability Less More
9. Applications More Less
10. Cost Less More

11. User’s skill Not required Required

12. Time for a typical Four hours Two to four days

experiment
 Avantajele PCR

PCR in diagnostic clinic

PCR in secventierea ADN
PCR in medicina legala
PCR in modificarea secventei si expresiei genelor
PCR in studii comparative de genomica
 Limitari

 Structura secventelor ADN

Dimensiunea secventelor
 Rata de eroare in timpul amplificarii
Sensibilitatea la inhibitori
Contaminarea