SECUENCIACIÓN

Secuenciación DNA por el método de Sanger:

Secuenciación DNA por el método de Sanger:
Después de los avances de Sanger, fue necesario idear estrategias para aumentar el número y
longitud de fragmentos que se podían secuenciar.

GENOTECAS:
Genomas de organismos cortados por endonucleasas (ADNsa I o enzimas de restricción) y su
posterior inserción en vectores (primero bacteriófagos y luego plásmidos).

Como se conoce la secuencia flanqueante, es posible usar primers para realizar la secuenciación
de Sanger de todos los fragmentos.
•Mediante herramientas bioinformáticas
desarrolladas especialmente para eso se arma la
secuencia final.

•A este proceso se le llago “whole genome shotgun”

(WGS).

•Los fragmentos se cortan con diferentes enzimas lo

que da fragmentos de diferentes tamaños.

•Cuanda ya están secuenciados, se sobrelapan y se

construye la secuencia.

•Otra estrategia es hacerlo en cierto orden pero el

paso de la fragmentación en diferentes tamaños y
después sobrelape es el mismo.

By Commins, J., Toft, C., Fares, M. A. - "Computational Biology

Methods and Their Application to the Comparative Genomics of
Endocellular Symbiotic Bacteria of Insects." Biol. Procedures Online
(2009). Accessed via SpringerImages., CC BY-SA 2.5,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=17509619
Secuenciación Masiva (Pirosecuenciación)
2da Generación:
 Pirosecuenciación o Tecnología 454 de Life Sciences

http://decodingdna.yolasite.com/parallelized-pyrosequencing.php
(Ion Torrent de Applied Biosystems) 3ra
Generación:
•También utiliza nanoreactores (como la
pirosecuenciación) y después una amplificación en
los mismos como en la segunda generación.
•Adicionalmente utiliza el sistema de adición y lavado
de bases.
•La diferencia con Illumina es que usa dNTP’s sin
modificaciones ya que lo que se detecta en la síntesis
de la cadena es la liberación del protón al formar el
puente de hidrógeno con la base complementaria, lo
que genera un ligero cambio de pH en el
microambiente.
•Si se adicionan más bases iguales consecutivas, la
señal de cambio de pH es mayor ya que hay mayor
número de H+ libres en el ambiente.
Secuenciación por Síntesis (Solexa/Illumina)
3ra Generación:
•Las bibliotecas genómicas utilizadas para secuenciar pueden tener fragmentos hasta de 1000
bases.
•En vez de hacer la reacción dentro de nanoreactores y después una amplificación en los
mismos, se adhieren adaptadores a cadenas sencillas. Dichos adaptadores se hibridan con
adaptadores complementarios sobre laminillas de vidrio para posteriormente amplificar por
clusters.
•Después de la amplificación, se remueve una de las cadenas para generar nuevamente cadenas
sencillas.
•Nucleótidos modificados con fluoroforos se adicionan para diferenciar cada letra que son
excitados por un láser.
•Se toman fotografías para observar donde se incorporó el nucleótido.
 SMRT Sequencing Technology
S-Single
M-Molecule
R-Real
T-Time

-Utiliza nanoestructuras que simulan pozos de aluminio con fondo translúcido.

-Se llaman ZMW (zero-mode waveguide) y tienen la propiedad de eliminar fuentes luminicas externas
con el objetivo de detectar un pulso de luz al realizarse la reacción de polimerización de nucleótidos a
una sola cadena creciente.
-Una enzima ADN polimerasa se encuentra anclada al fondo de los pozos.
-Los nucleótidos utilizados están marcados con fluoróforos que emiten diferentes colores
dependiendo de la base.
-En comparación con los ddNTPs de Sanger, los fluoróforos están anclados al PPi por lo que al
realizarse el enlace fosfodiester, estos se alejan de la cadena naciente.
-El equipo detecta el pulso de luz al realizarse la polimerización y después su disminución cuando el
PPi se aleja del fondo.
http://decodingdna.yolasite.com/gridion.php
https://www2.nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing
Secuenciación por Nanoporos:
-Se trata de membranas de polímeros sintéticos con poros formados por proteínas (a-
hemolisina de Estafilococo).
-El poro es suficientemente ancho para dejar pasar una cadena sencilla de ADN.
-A través de la membrana se hace pasar una corriente eléctrica.
-Al paso de cada nucleótido o grupo de nucleotidos, la corriente se ve interrumpida con
diferente intensidad dependiendo de cada nucleotido o secuencia.
-La interrupción es medida por el equipo y asigna la identidad a cada nucleotido o secuencia
-Para que la cadena de ADN pase por el poro, una enzima procesiva está anclada a la a-
hemolisina.
-No es necesario sintetizar ninguna cadena para obtener la secuencia.
-Puede leer a una velocidad de 1nt/ms y en teoría no tienen límite de longitud.
Links:
Illumina:
https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM

Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT):

https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI

Strand Sequencing: (Nanopore Seq.):

https://www.youtube.com/watch?v=3UHw22hBpAk

https://www.youtube.com/watch?v=e9wtAIvPPxY

https://www.youtube.com/watch?v=m7fNinCP5Ao

Otros:
http://decodingdna.yolasite.com/