Genomas Secuenciados En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma de organismos eucariotes Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son: 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemátodo 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca de la fruta 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito vector de la malaria Secuenciación de ADN Método de Sanger (nobel en 1980) Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para terminar una reacción de síntesis de ADN in- vitro Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original. Secuenciación automática Sigue el mismo principio A diferencia del método anterior cada ddNTP se marca con una molécula fluorescente diferente Esto permite realizar una única reacción en la cual están presentes los 4 ddNTPs marcados Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis capilar La detección se realiza en un punto fijo al final de la corrida Secuenciadores automáticos de ADN ABI Prism 3700 Secuenciación de genomas Cada reacción de secuencia es capaz de leer unas 500 pb. Como se obtuvo la secuencia continua del conjunto de los cromosomas humanos. Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb (genoma completo 109). Construcción de biblioteca de ADN genómico fragmentado al azar Lectura de secuencias individuales Las secuencias individuales son solapadas y ensambladas (contigs) Para asegurarse de que todas las secuencias estén representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma La velocidad de producción de las secuencias ha ido en aumento. Recientemente se dió un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de “próxima generación” No usan terminación de cadena Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue incorporada a cada molécula que se esta secuenciando Producen en una única reacción de secuencia millones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelización) 108 1010 bases por corrida (menos de 1 día) De esta forma se secuenció el genoma entero de Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo Sistema Multiplex