HPLC POR GRADIENTE

Elución por gradiente

Achig Bryan
Albán María Judith
Paucar Martín
Yánez Andrés
GRUPO 4
 OBJETIVOS
• Explicar los problemas que se pueden encontrar al
usar HPLC isocrática.
• Demostrar cómo se pueden superar estos problemas
utilizando gradiente de HPLC.
• Demostrar por qué las formas de pico en HPLC de
gradiente son más eficientes que las obtenidas de
HPLC isocrática.
• Examinar los efectos de la pendiente del gradiente y
mostrar cómo se pueden determinar prácticamente
los diversos parámetros de gradiente.
• Examinar las desventajas y las ventajas de la HPLC de
elución en gradiente en una situación práctica.
 ANÁLISIS DE HPLC ISOCRÁTICO
• Cuando la composición de la fase móvil no cambia
durante un análisis el método es isocrático.
• Problemas
• Cuando el rango de polaridades del analito es
amplio, es posible que algunos analitos se
retengan escasamente y se pierda la resolución
con picos que se eluyen en o cerca del volumen
muerto (tm).
• Alternativamente, otros componentes del
analito pueden ser significativamente más
hidrófobos y mostrar tiempos de retención
inaceptablemente largos.
• Debido a los diversos procesos de
ensanchamiento de banda, estos picos de elución
tardía serán amplios y mostrarán una sensibilidad
reducida debido a la altura de pico reducida.
 ANÁLISIS DE HPLC DE GRANDIENTE
• La composición de la fase móvil se altera durante el
análisis, normalmente aumentando la cantidad de
modificador orgánico.
• La composición inicial se elige para que la fuerza
sea adecuada para retener y resolver los analitos
que eluyen tempranamente.
• La composición final de la fase móvil se elige para
garantizar la elución de todos los compuestos de
interés de la columna dentro de un tiempo
razonable.
• La elución en gradiente es más adecuada para los
análisis llevados a cabo utilizando fases reversas, Columna: ZORBAX C18, 4.6 x 150 mm, 5 μm
separaciones de fase normal usando fases Fase A: H2O con 0.1% TFA, pH 2
estacionarias unidas, y para la cromatografía de Móvil: B: Acetonitrilo
intercambio iónico. Flujo: 1.0 mL/min
Temperatura: 35 °C
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
• Ventajas de la elución de gradiente:
• Resolución mejorada.
• Mayor sensibilidad.
• Posibilidad de separar muestras complejas.
• Tiempos de análisis más cortos.
• Desventajas de la elución de gradiente:
• Instrumentación más costosa.
• Posible precipitación en las interfaces de solvente cuando se usan válvulas de
dosificación (mezcladoras) múltiples.
• El tiempo de reequilibrio aumenta el tiempo de análisis.
 PARÁMETROS DE GRADIENTE DE ELUCIÓN
Solvente
A
Dos más débil
solventes Solventes
B
más fuerte

La fuerza de la elución incrementa con el tiempo.

La mezcla de la fase móvil puede se realiza con bombas de HPLC. Existen dos
métodos:
• Mezcla de baja presión: los solventes son inyectados con baja presión
utilizando válvulas selenoides.
• Mezcla de alta presión: los solventes son inyectados por dos o más
bombas con diferentes flujos dentro de la cámara de mezcla.

*Para ayudar con la mezcla de los solventes, se realiza un dopaje.

• EJEMPLO: gradiente HPLC fase reversa de un herbicida

Condiciones manejadas:
Columna: C8, 4,6x150mm, 5um
Fase móvil:
• A: H2O con 0,1% TFA, pH 2
• B: Acetonitrilo
Flujo: 1,0 ml/min
Temperatura: 35°C
 OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE
GRADIENTE
• %B Inicial: composición de la fase
móvil expresada en términos del
porcentaje del disolvente fuerte en B
• Presión isocrática inicial: período en
el que la composición de eluyente se
mantiene en el %inicial de B, esto
ayuda a un mejor enfoque del analito.

• Tiempo de gradiente (tG): tiempo en el que la composición del eluyente está cambiando
• %B Final: composición final de B en la fase móvil
• Purga: en este momento se eluyen componentes fuertemente retenidos (sin interés analítico) de la
columna
• Acondicionamiento: devolver el sistema (columna) a la composición de gradiente inicial (muy rápido).
• Equilibrio: tiempo para garantizar que toda la columna analítica vuelva a la composición gradiente inicial
• Velocidad de cambio de la fase móvil durante la gradiente:
∆%𝐵 %𝐵𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − %𝐵𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
=
𝑚𝑖𝑛 𝑡𝐺

• Optimización de %B inicial y %B final:

∆%𝐵 𝑉𝐷 ∆%𝐵
𝑂𝑝𝑡𝑖𝑚𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖ó𝑛 %𝐵𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = %𝐵𝑖𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 + 𝑡𝑖 ∗ − ∗ − 10%B
𝑚𝑖𝑛 𝐹 𝑚𝑖𝑛
∆%𝐵 𝑉𝐷 ∆%𝐵
𝑂𝑝𝑡𝑖𝑚𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖ó𝑛 %𝐵𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = %𝐵𝑖𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 + 𝑡𝑓 ∗ − ∗ − 10%B
𝑚𝑖𝑛 𝐹 𝑚𝑖𝑛

• Tiempo requerido para el equilibrio

2(𝑉𝐷 + 𝑉𝑚 )
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑒𝑙𝑞𝑢𝑖𝑙𝑖𝑏𝑟𝑖𝑜 =
𝐹
 PRINCIPIOS DE ELUCIÓN DE GRADIENTE
• Intensidad baja de la fase móvil
• El analito se divide por completo en la fase estacionaria en la cabecera de la columna
REGIÓN A

• La fuerza de la fase móvil aumenta y analito comienza a dividirse en la fase móvil ya moverse a lo largo de la
columna
• A medida que la fuerza de la fase móvil aumenta, la velocidad con la que el analito se mueve a lo largo de la
REGIÓN B columna se acelera.

• El analito se divide completamente en la fase móvil

• La velocidad lineal es constante
REGIÓN C
FORMAS DE PICO EN HPLC DE
GRADIENTE.
En la elución isocrática, los
picos amplios, y el ancho
del pico aumenta con el
tiempo de retención.

En elución de gradiente, los

picos son estrechos con
anchos de pico casi iguales.
• Elución del analito en condiciones isocráticas.
 Una forma de En la elución en
pico estrecho gradiente, todos
es la velocidad los compuestos
aceleran a través
del pico cuando de la columna y
sale de la eluyen a alta
columna. velocidad.

La diferencia de Todos los

tiempo de retención compuestos
entre los compuestos deben tener la
es consecuencia del
porcentaje de misma
modificador orgánico velocidad
donde cada uno se cuando salen
acelera.
de la columna.
Enfoque máximo
El frente y la cola de un pico están en diferentes
concentraciones de modificador orgánico.

La cola experimentará un mayor porcentaje de modificador

orgánico que el corazón de un pico.

La velocidad de la cola será un poco más alta que el corazón del pico
y viceversa para el frente. Enfoque máximo.

Picos asimétricos problema con menor frecuencia en la

elución en gradiente.

Los picos angostos en la elución en gradiente

proporcionan mejores límites de detección y mayores
capacidades de carga.
• Analice la elución en condiciones de gradiente.
 GRADIENTES DE EXPLORACIÓN

La fuerza de elución se
Es un gradiente lineal de 5- Para la elución de gradiente
mantiene al 100% B durante
10% de B a 100% de B de fase inversa, el agua (o el
unos minutos asegurándose
durante un tiempo tampón analitos ionizados) y
de que todos los
establecido (20 min el acetonitrilo son los
componentes se hayan
estándar). eluyentes de elección.
eluido.
• Gradiente de exploración usado para evaluar la viabilidad de realizar una
separación isocrática y calcular el % B inicial para una separación de gradiente.
 Si los compuestos eluyen después de 25
minutos en nuestro ejemplo, entonces se
requiere un disolvente B más fuerte para el
análisis o una columna menos retentiva.

Se prefiere una separación isocrática ya que

aumenta el rendimiento de la muestra (sin
tiempo de reequilibrio) y simplifica el análisis.

La composición de fase móvil, en la que se

eluye el primer pico, se debe usar como la
composición de fase móvil inicial cuando se
desarrolla un gradiente.
 PENDIENTE DE GRADIENTE
• Controlada por la composición de inicio, finalización de la fase móvil y el
tiempo de gradiente.
• La pendiente del gradiente de fase móvil puede tener un efecto significativo
en la separación.
 El factor de retención (k *) en HPLC
de gradiente es diferente de la
elución isocrática. (k *) de cada La ecuación puede
analito cambia a medida que se reordenarse para obtener
una expresión que prediga
altera la fuerza eluotrópica de la fase el tiempo de gradiente,
móvil, puede considerarse como un basándose en un gradiente
valor medio de k en la separación. de exploración.

Un buen valor de inicio

para k* es 5. Las
condiciones de gradiente
se deben verificar para
asegurar que se logre un
valor razonable de k *.
 ∗
𝑡𝐺 𝐹
𝑘 =
𝑆∆Φ𝑉𝑚

Donde:
k * = valor objetivo de 5 para la separación promedio
tG = tiempo de gradiente (min)
F = tasa de flujo (mL / min)
Δφ = cambio en la fracción de volumen de orgánico (% B final -% B inicial)
expresado como un decimal
Vm = volumen intersticial de la columna (μL)
 2
𝑑𝑐
𝑉𝑚 = 𝜋 𝐿0,68
2
Donde:
dc = diámetro de columna (mm)
L = longitud de columna (mm)
S = factor de selectividad de forma (5 es una buena estimación para
moléculas pequeñas)

𝑆 = 0,25𝑀𝑊 0,5
• S = factor de selectividad de forma
• MW = peso molecular compuesto
• Es poco probable que los tiempos de gradiente por encima de los
estimados por la ecuación mostrada produzcan una mejor resolución.
• Tiempo de degradado teórico.
• Más tiempo de degradado no mejorará considerablemente la resolución.

𝑘 ∗ 𝑆∆Φ𝑉𝑚 Dónde: k * = 5 para la separación

𝑡𝐺 =
𝐹 promedio
S = 4 para moléculas pequeñas
5∗4∗0,95∗1,7
𝑡𝐺 = =16,15 min Δφ = 5-100% = 95% = 95/100 = 0.95
2
Vm = 1,7 ml (columna de 4,6 x 150
mm)
F = 2 ml / min
 ¿CÓMO OPTIMIZAR UN ANÁLISIS DE GRADIENTES?
• TIEMPO DE GRADIENTE MÁS LARGO • COLUMNA MÁS CORTA
• TASA DE FLUJO MÁS ALTA

• RANGO ORGÁNICO MÁS CORTO

• Dependerá del parámetro que se modifique y del tipo de aplicación específico.
 HPLC GRADIENTE PRÁCTICO

• Aplicaciones que utilizan aditivos fuertemente retenidos

La elución de gradiente puede no • Aplicaciones de par de iones
ser adecuada para: • Cromatografía líquida de fase normal en sílice desnuda debido
a la adsorción de agua y la irreproducibilidad
Gradientes segmentados

• Los picos mal resueltos requieren un

cambio en la pendiente del gradiente

• La segmentación del gradiente permitirá un

control independiente sobre las partes
iniciales y posteriores del cromatograma, lo
que dará como resultado la separación
satisfactoria de ambos pares críticos.
OPTIMIZACIÓN DE GRADIENTES SEGMENTADOS

Desde el gradiente inicial,

la pendiente se puede
segmentar de infinitas
maneras
comenzar desde el
gradiente inicial y
superponer una cuadrícula