Citometría de Flujo y

Separación de Linfocitos
Angello Alarcón Agudelo
Zharick Avalo Largo
Yermain Ulabarri
Citometría de Flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis
celular que mide múltiples parámetros, y cuyo
fundamento se basa en hacer pasar células en
suspensión por delante de un haz de láser
focalizado.

Objetivos:

- Identificar y caracterizar subpoblaciones

celulares.
- Seleccionar y separar subpoblaciones celulares
por sorting.
- Medir la capacidad funcional de las
subpoblaciones celulares.
Parámetros medidos por citometría
Intrínsecos:
Se relacionan con características
morfológicas de la célula:
● Tamaño y forma celular
● Granularidad citoplasmática
● Contenido de pigmentos
● DNA y RNA
● Cantidad de bases de DNA
● Cromatina
● Estructura del citoesqueleto
Extrínsecos:
Ponen de manifiesto estructuras localizadas
en la membrana, citoplasma o núcleo:
● Antígenos
● Azúcares superficiales
● Grupos químicos
● Receptores
Componentes de la citometría de flujo
● Sistema de fluidos: Sistema de
inyección, cámara de flujo
● Sistema óptico: Fuentes de luz,
detectores, espejos y filtros
● Sistema informático:
Amplificador/Convertidor,
software de adquisición/análisis
Sistema de fluidos
Un sistema hidráulico transporta células hacia el
centro del láser de una en una. Se produce un
flujo laminar cuando interaccionan los fluidos de
la muestra y el del envolvente (PBS).

- Por presión diferencial, las células penetran

en el centro del fluido, pero el PBS y la
muestra no se mezclan.
- Las células salen por el tubo que conecta la
muestra de forma desordenada y luego se
alinean una por una.
Cámara de flujo
El punto de interrogación es la base del sistema, pues allí es donde las células ya
alineadas, pasan una por una por un láser, que dependiendo de la difracción y la
fluorescencia recoge información sobre el tamaño y granularidad de la célula.
Sistema óptico
Es el encargado de recoger la luz difractada y/o la
luz emitida por los fluorocromos para enviarla a
los detectores.

Tipos de láser

- Ión argón de 488 nm

- Láser kripton de 568 nm
- Láser helio-neón de 633 nm
Detectores de luz
Los detectores son los encargados de recibir la luz
dispersada y de cuantificarla.

● Forward Scatter: Recoge luz difractada a ángulos

pequeños (0-10°). Es proporcional al tamaño de la célula
o partícula.
● Side Scatter: Recoge luz difractada a 90°. Es
proporcional a la complejidad estructural de la célula o
partícula.
● Detectores laterales adicionales: Recogen la
fluorescencia de anticuerpos monoclonales para
inmunofenotipo.
Señales de fluorescencia
Los fluorocromos son moléculas que aceptan
energía lumínica a una longitud de onda y la
desprenden a una longitud de onda mayor. Su
elección depende del láser del citómetro.

La diferencia entre la longitud de onda de

absorción y la de emisión se denomina stokes
shiff.

Se marcan Ac con fluoróforos que se unen a

antígenos específicos y emiten luz.
Filtros para fluorescencia
● De absorción: Absorben ciertas
longitudes de onda y permiten el paso
de otras.
- Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de
longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm).
- Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de
una longitud de onda determinada ( Por ej: <
575 nm).
- Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de
una longitud de onda determinada (Por ej: >
520 nm)
Sistema informático
Consiste en la captación de datos, el procesamiento de la
información y la representación de resultados final para el
usuario que interpretará los datos.

Un impulso de voltaje se crea cuando una partícula entra

en el haz de láser y empieza a dispersarse la luz o
fluorescencia.

Un pulso de voltaje, es proporcional tanto al tamaño como

a la densidad del núcleo de la célula (organelos) de esta
manera cada pulso se clasifica y se organiza en un
histograma, permitiendo saber la repetición de las células
con sus diversos tamaños y densidades.
HISTOGRAMAS
El conteo de pulsos de cierta magnitud
en función de cada canal digital da como
resultado un histograma de único
parámetro.

Si cada histograma de resultados, de luz

frontal y luz lateral se combina da como
resultado un dispersograma.
CITOGRAMAS
Se pueden delimitar distintas regiones en
función de la intensidad de la fluorescencia
emitida por las células, que corresponden a
ciertas características de cada grupo.

El gating es la separación de los grupos

celulares, normalmente con fines diagnósticos.

La computadora analiza los centroides y los

compara estadísticamente con los datos
recolectados y determina si un grupo de datos
es o no de ciertos grupos de análisis celular.
 Citometría de Flujo
VENTAJAS DESVENTAJAS

● Analiza un elevado número de células en ● Sólo los operadores cualificados y

un corto periodo de tiempo. muy calificados pueden ejecutarla, y
● Puede utilizar para medir muchos obtener los niveles aceptables de
parámetros, y obtener medidas rendimiento de un aparato de este
tipo.
cualitativas y cuantitativas de cada célula,
● Los citómetros de flujo son
siendo una técnica con alta sensibilidad, instrumentos caros de comprar y
especificidad y objetividad. mantener.
● Permite diferenciar poblaciones celulares
y determinar diferencias en tamaño y/o
complejidad.
Separación de linfocitos
La separación de linfocitos se realiza para muchas pruebas inmunológicas in vitro
donde se requieren preparaciones purificadas o enriquecidas de linfocitos de la sangre
periférica. Algunos ejemplos son:

-Recuento de linfocitos T y B por métodos manuales

-Pruebas de respuesta proliferativa hacía mitógenos en cultivo
-Determinación de antígenos HLA
-Investigación.

Viabilidad celular: Es una determinación de cuántas células vivas y muertas hay

tomadas de una muestra en concreto.
Las células del sistema inmune se puede separar por:

Gradiente de Ficoll Hypaque

Gradiente de Percoll

Columnas de Nylon

Técnicas inmunomagnéticas

Citotoxicidad mediada por Ac-

complemento

Cuantificación mediante rosetas

GRADIENTE DE FICOLL-HYPAQUE
Se basa en la separación de las células en un
tubo, dependiendo de diferentes gradientes
de densidad, es decir por centrifugación se
van a separar según su masa, existe dos
componentes importantes:

El ficoll 400: Genera la aglutinación de los

eritrocitos, lo cual facilita aún más la
sedimentación.

El diatrizoato de sodio:Genera la densidad

óptima para la separación y a la vez la
osmolaridad adecuada para mantener la
viabilidad de las células.
Fundamento de la Prueba
Al estratificar una muestra de sangre sobre
el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las células
mononucleares se separan de las demás
debido a diferencias de densidad.

Los mononucleares (linfocitos y monocitos),

por su menor densidad, se quedan en la
interfase entre el plasma y el medio. Este
procedimiento permite recuperar alrededor
de un 50% de los linfocitos presentes en la
muestra, con una viabilidad mayor del 90%
LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA
Leucemia linfoide aguda:
Es una enfermedad neoplásica que resulta de una
proliferación clonal de precursores linfoides
(linfoblastos) que:

- Infiltra médula ósea

- Produce un grado variable de pancitopenia
- Puede comprometer diferentes órganos y/o
sistemas
- Causa la muerte por hemorragia y/o infección

Es generalmente una patología de niños (2-5 años).

Clasificación:
La clasificación FAB definió tres tipos de LLA basándose en criterios morfológicos:
Fisiopatología
Epidemiología - En Colombia se estima que se
presentan aproximadamente
2.080 casos nuevos por año de
cáncer en pacientes pediátricos
y de estos 500 corresponden a
LLA.
- La situación de las leucemias en
niños constituye un problema
que debe ser considerado como
una enfermedad de interés en
salud pública
- La tasa de curación es cercana al
56% de acuerdo a datos aún no
publicados por el INC, cifra aún
distante a la descrita a nivel
mundial.
Manifestaciones Clínicas:
● Anemia
● Fatiga
● Sangrados
● Pérdida de peso
● Dolor osteoarticular
● Hepatomegalia
● Esplenomegalia
● Linfadenopatías
● Infiltraciones a hígado, bazo y SNC
Criterios Diagnósticos
Es importante obtener un diagnóstico preciso del
tipo de leucemia, pues el diagnóstico exacto ayuda
al médico a: prever la progresión de la enfermedad
y a determinar el tratamiento adecuado.

Citoquímica: MPO, Cloroacetoesterasa y Sudan

Black (-), P.A.S (+)

Citogenética: BCR-ABL1 (p190 – p210), MLL-AF4,

ETV6-RUNX1 y TCF3-PBX1. Los rearreglos clonales
en genes que codifican para cadena pesada de
inmunoglobulinas (IgH) y/o de genes del receptor de
células T(TCR) definen linaje.
Inmunofenotipo
La evaluación del fenotipo inmunológico por
citometría de flujo multiparamétrica (CFM)
define el linaje celular comprometido y es
fundamento para la clasificación actual de
las entidades clínico biológicas que plantea
la OMS.

Hay estrategias de screening para identificar

la línea involucrada: B, T o mieloide con
marcadores de línea conservados en toda la
ontogenia.
Algoritmo Diagnóstico
Factores Pronóstico
 Separación de Linfocitos: Fase Pre-analítica:
La muestra se toma de:
● Importante tener FicollHypaque a
• Sangre periférica temperatura ambiente.
• Órganos linfoides
● Máximas medidas de esterilidad y
• Otros tejidos
bioseguridad
Materiales:

• Medio de separación: mezcla de 2

componentes: (densidad 1.078 g/ml)
Ficoll, Diatrizoato de sodio.
• PBS → Buffer fosfato salino (solución
salina amortiguada con fosfatos)
• Centrifuga
Separación de Linfocitos: Fase Analítica
Determinación de viabilidad
El azul tripán: (azul diamina, azul
niagara, azul vital) es un colorante
derivado de la toluidina que posee la
capacidad de teñir a tejidos y células
muertas.
 Gradiente de percoll
● Es una herramienta para realizar separaciones
por densidad de forma más eficiente porque
posee una viscosidad baja, osmolaridad baja y
nula toxicidad para las células o sus
componentes.
● Compuesto por partículas de sílice coloidales
recubiertas por polivinilpirrolidona (PVP)
● sirve como una doble purificación.
● Se utiliza en el aislamiento de células, orgánulos
y virus mediante centrifugación en gradiente de
densidad.
Separación de linfocitos por adherencia al nylon
Está basado en la adherencia diferencial de
linfocitos T , linfocitos B y monocitos a la lana de
nylon a 37 °C

● Los linfocitos T no se adhieren a la lana de

nylon
● Los monocitos se adhieren a la lana y no se
pueden separar de esta
● Los linfocitos B se adhieren a la lana pero se
pueden separar ejerciendo presión
mecánica sobre la lana y el medio líquido en
el que se realiza el proceso
Inmunomagnetismo
La separación inmunomagnética se
basa en la interacción entre
antígenos celulares superficiales y
anticuerpos unidos a bolas
magnéticas.

permite separar:

● Las células unidas a las bolas

(selección positiva).
● Las células no unidas
(selección negativa).
Citotoxicidad mediada por anticuerpo-complemento
Consiste en eliminar los linfocitos B o T empleando Ac que se unan
diferencialmente a linfocitos B o T y una vez que se hayan unido los Ac añadir
complemento el cual se activará por la vía clásica (que es la de unión a Ac) y lisa a
los linfocitos que tienen los Ac unidos a las moléculas de superficie.
Cuantificación de linfocitos por medio de rosetas
Los linfocitos T humanos poseen
una propiedad muy particular de
unirse espontáneamente a los
eritrocitos de carnero in vitro,
formando agrupaciones llamadas
rosetas E.
Este fenómeno se debe a que los
linfocitos T humanos poseen en su
superficie un receptor CD2, que
media la unión con los eritrocitos de
carnero.
Citometría de Flujo: Fase Pre-analítica:
1. Orden médica
2. Preparación e identificación del
paciente
3. Toma de la muestra:

Aspiración y biopsia de la médula ósea: las

muestras de médula ósea se obtienen por
aspiración y biopsia de la médula ósea, pruebas
que generalmente se hacen al mismo tiempo.
Generalmente las muestras se toman de la parte
posterior del hueso de la pelvis (cadera), aunque
en algunos casos se pueden tomar del esternón o
de otros huesos
 5. Preparación de la muestra

● Muestra de rimado y/o médula se pone

un recipiente estéril.
4. Preparación e identificación del paciente ● La muestra debe ser transferida a un
tubo con EDTA (0,2 ml EDTA: 1ml MO)
● Evitar dietas ricas en grasa entre 8 y 12 ● Debe ser transportada a temperatura
horas ambiente y en oscuridad al laboratorio
● Evitar el ejercicio intenso 24 horas antes de hematología.
● Evitar el estrés y el cigarrillo mínimo 2
horas antes
● Permanecer en reposo 15 minutos antes
del procedimiento
● Horario más adecuado para la toma de
muestra es de 7:00am - 9:00am
Citometría de flujo: Fase Analítica
6. Disgregación de las muestras de MO

● Volumen mínimo requerido: 5ml

● Depositar en un mortero estéril, con
PBS pH 7,2 + EDTA 2mM
● Macerar y deshacer el material óseo.
● Filtrar con gasa estéril para eliminar
exceso de grasa y espículas de hueso
que pudieran interferir en el marcaje
mediante CMF
Fase Analítica: Marcaje de antígenos de membrana y citoplasma mediante
citometría de flujo
● Anticuerpos monoclonales y policlonales combinados
en 4 fluorescencias distintas (Fluorocromos:
FITC/PE/PERCPCY5.5/APC)
● Protocolo que combina marcaje celular de antígenos
de membrana y de citoplasma
● Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente y
en oscuridad.
● Adicionar 1 mL de solución de lisis (FACS lysing
solution-BDB) durante 10 minutos
● Realizar dos lavados con 2 mL de PBS
● Centrifugar por 5 minutos a 2000 rpm
Anticuerpos y marcaje celular
Para la caracterización inmunofenotípica de las LA,
se debe de emplear un panel de AcMo dirigidos
contra los antígenos intracitoplasmáticos:
mieloperoxidasa (MPO), CD3 y CD79a, el cual
permitirá determinar el linaje celular leucémico:
mieloide, T y B, respectivamente.

A partir de este panel, se le adicionará el resto de

los marcadores específicos de linaje y los
relacionados con el estadio de maduración celular
(CD34, CD45, CD117, CD7, CD5)
CD: cluster differentiation,
FITC: isotiocianato de
fluoresceína

PE: ficoeritrina,

PerCP: peridinina clorofila

proteína,

APC: aloficocianina,

BDB: Becton Dickinson

Bioscience
 Marcaje de antígenos de membrana y citoplasma
1. Se realiza el marcaje de antígenos de
membrana.
2. Seguido de incubación con 100 uL de solución
fijadora (Reactivo A) y posteriormente se
adicionó solución de permeabilización (Reactivo
B) para la detección inmunológica de antígenos
intracelulares
3. Las incubaciones en cada paso fueron
realizadas durante 30 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad, seguidas de lavados
con PBS.
Fluorocromo FITC PE PERCP APC Esferas

Cantidad por 5 uL 5 uL 5 uL 3 uL 10uL

tubo

FITC, isotiocianato de fluoresceína, PE, ficoeritrina, PerCP, peridinina

clorofila proteína, APC, aloficocianina, n: antígeno nuclear, cy:
antígeno citoplasmático
Calibración: Citometro de flujo
● La calibración depende del grado y de la
magnitud de la dispersión de la luz del láser al
interactuar con los componentes celulares, que
se obtiene a través del análisis de la muestra que
contiene solamente sangre total, la cual funciona
como un control negativo.
● Verificar la alineación óptica diaria
● La estandarización y la compensación de la
superposición espectral.
● La calibración del equipo se realiza empleando
microesferas fluorescentes (Calibrite BDB)
siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Compensación: Citometro de flujo
● Una vez realizado el marcaje y comprobada la calibración del citómetro, se lleva a
cabo la compensación del equipo. La compensación de la fluorescencia debe
realizarse con el marcaje pertinente, sobre las subpoblaciones linfocitarias de SP
procedentes de individuos clínicamente normaL.

● Se emplea una muestra de sangre periférica normal marcada con las siguientes
combinaciones de anticuerpos monoclonales en cuatro fluorescencias distintas:
CD3FITC/CD4PE/ CD3PERCP/CD8APC.

● Posteriormente, se ajustan las señales de fluorescencia y voltajes de cada detector

(FL-1/ FL-2, FL-3 y FL-4) con el fin de asegurar la discriminación adecuada entre las
señales positivas y negativas.
Fase Post-analítica: Análisis de resultados
El análisis de los datos se debe de
llevar a cabo mediante un programa
informático, ej: Paint-A-Gate BDB, se
seleccionan las células de interés por
su expresión de marcadores
específicos de línea y su granularidad.
Fase Post-Analítica: Análisis de resultados
LLA-B

Para definir el linaje B, los blastos deben

expresar fuertemente el antígeno CD19, el
cual tiene que estar asociado con al
menos uno de los siguientes antígenos:
CD79a citoplasmático, CD22
citoplasmático o de membrana y el CD10.
Por lo tanto, la expresión sólo del CD19 no
es suficiente para confirmar el fenotipo B.

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0025-
76802010000200009
Fase Post-Analítica: Interpretación de resultados
LLA-T

Para definir el linaje T, los blastos

leucémicos deben expresar
fuertemente el antígeno CD3
citoplasmático o en la membrana
celular, el cual debe estar
asociado con al menos uno de los
siguientes marcadores: CD2, CD7
y CD5. Estos tres antígenos, si
bien son sensibles, no son
específicos de linaje T; así CD2 y
CD7 pueden estar expresados
también sobre precursores
mieloides
ARTÍCULOS
BIBLIOGRAFÍA
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