DIAGNOSTICO VIRAL

1º Examen citilogico de la 4º Serologia viral

muestra – Citología. Fijación de complemento
Papanicolao Neutralización
Seller Inhibición de la
2º Detección de Ag virales hemoaglutinación
Técnica con Ac fluorescente IFI
Radioinmunoanalisis Elisa
Elisa CIE
Hibridación de ácidos RIA
nucleicos 5º Aislamiento y Cultivo
3º Microscopia electrónica 6° Detección del material
genético viral
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION
DE VIRUS

CULTIVO:

I.- SELECCIÓN DE MUESTRAS PARA

CULTIVOS DE VIRUS:
• Garganta y nasofaringe (hisopos).
• Hisopos rectales y heces
• Orina
• Lesiones cutaneas
• LCR,otros liquidos esteriles
• Ojo.Sec. De la conjuntiva.
• Sangre
• tejido
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE VIRUS

II.-TRANSPORTE DE MUESTRA:
Rápido
Congelado-12 horas
Stuart modificado,hanksmodif. O leibovitz-
emory.

III.- MEDIOS Y CELULAS USADAS PARA

EL AISLAMIENTO DE VIRUS
a) Cultivos primarios
b) Líneas celulares continuas
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE VIRUS

a) CULTIVOS PRIMARIOS:
Monocapa de fibroblastos humano (HFD)
Monocapa de celulas de riñon y mono
(RMP)
b) LINEAS CELULARES CONTINUAS:
Hep-2
Hela
vero
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE VIRUS
IV.- INOCULACION DE LAS MUESTRAS.
Se inocula 0.25 ml.
Se incuba 35ºc en tambores giratorios
Se observa diariamente por 10 a 14 días
V.- IDENTIFICACION
Observación de ACP
Hemoabsorcion / hemoaglutinación de eritrocitos
de cobayo
Inhibición de la hemoabsorcion
Anticuerpos fluorescentes
Neutralización
Labilidad al acido
Ejemplos:
.Las células primarias de riñón de mono: Para
la recuperación de mixovirus, paramixovirus,
muchos enterovirus y algunos adenovirus.
.Las células diploides fetales humanas, en
general fibroblastos (amplio espectro de virus,
herpes simple, varicela zoster, adenovirus,
picornavirus), citomegalovirus.
.Las células Hep-2, línea continua de células
epiteliales procedentes de un cáncer humano
(Virus sincitial respiratorio, adenovirus, virus del
herpes simple.
 CITOLOGÍA
EFECTO CITOPATICO:
Muerte celular: Redondeamiento,
degeneración, agregación, perdida de
adherencia, lisis
Cambios histológicos: Cuerpos de
inclusión en el núcleo o en citoplasma,
sincitios: Células gigantes multinucleadas,
formadas por la fusión inducida por virus,
vacuolación.
 CITOLOGIA
Ejm. Citomegalovirus: Se observan
cuerpos de inclusión tipo ojo de buho en
núcleo. Virus rábico: Se presentan
cuerpos de Negri, inclusiones en el
citoplasma.
Cambios de la superficie celular,
expresión de antígeno virus,
hemadsorción.
 MICROSCOPIA ELECTRONICA

. Debe existir un número suficiente de partículas

víricas, para su detección.
. La adición de anticuerpos específicos para el
virus a una muestra, facilita detección
(inmunomicroscopia electrónica), v. entéricos.
. Examinar tejido de una biopsia o la muestra
clínica apropiadamente procesadas en busca de
estructuras víricas.
DETECCION DE PROTEINAS VIRICAS
(ANTIGENOS Y ENZIMAS)

.La replicación vírica produce enzimas y

otras proteínas que pueden ser
detectadas mediante técnicas
bioquímicas, inmunológicas y de biología
molecular)
.La presencia de transcriptasa inversa en
suero, o cultivo celular indica la presencia
de retrovirus
 .Los anticuerpos se pueden usar como
instrumento sensible y específico para
detectar, identificar y cuantificar la presencia
de virus y antígenos víricos en muestras
clínicas o cultivos celulares
(inmunohistoquímica) (anticuerpos
antivíricos marcados covalentemente con
sustancias fluorescentes, enzimáticas o
radiactivas.
.Los antígenos víricos, se pueden detectar
mediante inmunofluorescencia e
enzimoinmunoanálisis (IAE). Se conjuga
una enzima con el anticuerpo y se convierte
en cromóforo un sustrato para marcar el Ag.
 -Para la inmunofluorescencia directa
(IFD), se emplea un anticuerpo antivírico
primario fluorescente
-Para la inmunofluorescencia indirecta
(IFI), se usa un anticuerpo secundario
fluorescente, para reconocer el anticuerpo
antivírico primario y localizar el antígeno
 DETECCION DE MATERIAL
GENETICO VIRICO

.Se pueden usar sondas ADN con

secuencias complementarias para regiones
específicas de un genoma vírico, a fin de
detectar, localizar y cuantificar ácidos
nucleicos víricos en muestras clínicas
-Detectan el virus incluso en ausencia de
replicación vírica
-Utilidad especial en infecciones por virus
de replicación lenta o no productivas
 -Las sondas ADN se sintetizan por medios
químicos o mediante clonación de
fragmentos o un genoma vírico completo en
vectores bacterianos (plásmidos)
-Las copias ADN de virus ARN se preparan
con la transcriptasa inversa de retrovirus y
después se clonan en vectores
-Las sondas ADN son marcadas con
nucleótidos radioactivos o químicamente
modificados, para permitir su detección y
cuantificación
.Mediante hibridación in situ, los ácidos
nucleicos víricos presentes en extractos de
muestras clínicas se pueden detectar
mediante fijación de un pequeño volumen del
extracto en un filtro de nitrocelulosa, seguida
por hibridación del filtro con ADN vírico
específico marcado
-En el comercio existen ahora muchas
sondas víricas y equipos para la detección de
virus
.Reacción en cadena de la polimerasa
(RCP), permite detectar copias únicas de
ADN vírico, y es una de las técnicas de
análisis genético más nuevas.
-La reacción en cadena de la polimerasa es
un método rápido que amplifica una
secuencia de ADN conocida. La muestra se
mezcla con ADN polimerasa termoestable,
exceso de triofosfatos de
desoxirribonucleótido y dos olígómeros de
ADN (cebadores), que complementan los
extremos de la secuencia diana que se
desea amplificar.
.La mezcla se calienta para desnaturalizar el
ADN y después se enfría para permitir la
unión de los cebadores al ADN diana, y la
extensión de los cebadores por la
polimerasa. El ciclo se repite entre 20 y 30
veces. Después del primer ciclo sólo se
amplificará la secuencia delimitada por los
cebadores.
 SEROLOGIA VIRICA
.La serología puede usarse para identificar
el virus y su cepa o serotipo, evaluar el
curso de una infección, determinar si se
trata de una infección primaria o una
reinfección, o de una infección aguda o
crónica
.Los datos serológicos sobre una infección
vírica son proporcionados por el título y el
tipo de anticuerpos, y por la identidad de las
dianas antigénicas
.El diagnóstico serológico se utiliza para virus
difíciles de aislar y cultivar en cultivos de células,
y para los que producen enfermedad con un
curso más lento.
.La concentración relativa de anticuerpos se
conoce como título. Es la inversa de la mayor
dilución (concentración más baja) (ejm: dilución
1:64 = título 64)
.La producción de anticuerpos en respuesta a la
infección primaria conduce a seroconversión.
La detección de anticuerpos IgM indica
infección reciente, (2-3 semanas infección)
La seroconversión es indicada por aumento de
cuatro veces o mayor en el título de anticuerpos,
entre los sueros tomados durante la fase aguda
de la enfermedad y al menos dos o tres semanas
después, durante la fase de convalescencia
El curso de una infección crónica se puede
determinar también por un perfil serológico, en
especial en infecciones de curso lento (hepatitis B,
mononucleosis infecciosa por E. Barr). En general
los primeros anticuerpos que se detectan están
dirigidos contra antígenos
 más asequibles al sistema inmune (los presentes
en el virión o en la superficie de las células
infectadas, anticuerpos contra antígenos de la
envoltura y la cápside). En fases posteriores se
detectan anticuerpos dirigidos contra proteínas y
enzimas víricas intracelulares.
.Se puede usar una batería o panel serológico,
compuesto por pruebas para varios virus, en el
diagnóstico de ciertos síndromes.
Métodos serológicos:
.La fijación del complemento: La muestra de
suero del paciente se hace reaccionar con
antígeno y complemento que proceden del
laboratorio. Los complejos anticuerpo-antígeno
activan y consumen el complemento. La
cantidad de complemento residual se mide por
la lisis de hematíes recubiertos de anticuerpos.
(los anticuerpos aparecen en el curso de la
enfermedad)
.La neutralización y la inhibición de la
hemaglutinación (IH): Son las mejores pruebas
para detectar anticuerpos y su unión al virus
.La prueba de anticuerpos fluorescentes
indirectos, se puede utilizar para la detección de
anticuerpos específicos contra el virus presentes en
el suero del paciente
.La aglutinación de látex, es un método rápido y
sencillo de realizar para determinar la presencia de
anticuerpos o antígenos solubles. El anticuerpo
específico contra el virus causa aglutinación del
látex, recubierto con Ag viricos
.El análisis de inmunosorción ligado a enzimas
(ELISA), usa antígeno inmovilizado en una superficie
de plástico, perla o filtro, para capturar y separar el
anticuerpo específico contra el virus, de otros
anticuerpos presentes en el suero del paciente. El
anticuerpo del paciente fijado se detecta después
mediante un anticuerpo antihumano unido de forma
covalente a una enzima
La prueba de ELISA, también puede cuantificar el
antígeno soluble presente en una muestra clínica. Es
capturado por el anticuerpo, y después se detecta
mediante un anticuerpo distinto marcado con enzima
 La Western blot, es una variación más moderna de
la técnica ELISA. Las proteínas víricas separadas
mediante electroforesis, son transferidas a un papel
de filtro. Al contacto con el suero del paciente, las
proteínas inmovilizadas capturan los anticuerpos
específicos para el virus y se visualizan mediante un
anticuerpo antihumano conjugado con enzima.
Radioimnunoanálisis, utiliza anticuerpos o
antígenos radiomarcado.