Universidad de la Fuerzas Armadas-

ESPE

Biotecnología Industrial

Conservación de cepas
Integrantes: microbianas
• Acosta Jonathan
• Aguilera Cristina
• Ceracapa Sandy
• Gómez Nayara
• López Nathaly
• Paz Johanna
 Objetivos:

 Definir las características de una cepa microbiana

 Describir los métodos usados para conservar las cepas
bacterianas
 Analizar ventajas y desventajas en la utilización de los
diferentes métodos
 Cepa microbiana
Una variante fenotípica de una especie o, incluso,
de un taxón inferior

Las cepas se pueden agrupar según sus

características comunes:

biovar o biotipo, que son aquellas cepas que tienen

características bioquímicas y fisiológicas especiales.

morfovar o morfotipo, con morfología específica.

serovar o serotipo, con características antigénicas

específicas.

patovar o patotipo, con propiedades patógenas

para ciertos hospedadores.

fagovar o fagotipo, con especificidad para lisar

ciertos bacteriófagos
 Colecciones de cultivo

Se suministran a
los laboratorios
Diversos
Cepas de Células microbiológicos
materiales
microorganismos superiores o de biología
biológicos
celular bajo
pedido.

Organizaciones
que se ocupan
de guardar:
 Servicios que prestan las colecciones
de cultivo

Recolección,
conservación Identificación
y suministro microbianas Investigación

Recopilación Depósito de Asesoramiento

de datos de cepas en general
las cepas microbianas
Tiempo aproximado en el que los cultivos
bacterianos permanecen viables en
distintos tipos de almacenamiento.
 Objetivos de la conservación
microbiana

Las muestras
bacterianas son
Cultivo a Células
esenciales en la Tiempo de
Objetivos: conservar sea permanezcan
investigación, el conservación
puro estables
diagnóstico y la
enseñanza.
 Factores que
afectan la
Tiempo Contaminación
conservación
microbiana:

Susceptibilidad
Disponibilidad
del Costos
de equipos
microorganismo

Facilidad de
Cantidad de
que se den
muestras a
cambios
conservar
genéticos
 Clasificación de los métodos de
conservación
Métodos a largo plazo
Conservación por congelación
Conservación por liofilización
Métodos alternativos
Conservación por transferencia periódica
Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Métodos restringidos
Métodos no empleados habitualmente
Microorganismos muy determinados
No resisten bien la liofilización o la congelación
Eliminación del agua disponible para las células.
 1.-Métodos de conservación a largo plazo

Son los mejores

Aún así no se
puede descartar
Garantiza al máximo la algún cambio
estabilidad genética originado por el
método
preparatorio

Los métodos son dos:

congelación y
liofilización.
a)Conservación por congelación.

Existen cuatro
factores que influyen
Se toma células en equipos especiales=
en la viabilidad y
suspensión fallo del sistema
estabilidad de las
células conservadas

Se coloca un agente
inconveniente
crioprotector

Se almacena a
temperaturas
No hay crecimiento.
inferiores a cero
grados centígrados
 • Edad de las células

Utilizar células
maduras = inicio
de la fase
estacionaria

Estado que les

prepare para
condiciones
adversas
• Velocidad en la congelación y descongelación

Programas estandarizados

Mejor que las variaciones

de la temperatura sean
rápidas.

Descongelar :conviene
poner las células a 37ºC.
 • Temperatura de almacenamiento:

Sumergidos en Fase gaseosa del

nitrógeno líquido = – nitrógeno líquido = –
195ºC 140ºC.

Armarios congeladores
Tubos cerrados
= –70ºC. C-D

Este método no en
Tubos con criobolas microorganismos
anaerobios
 • Empleo de agentes crioprotectores:

Glicerol = 15 al 20%.

Evitan acumulación de electrolitos y formación de

Proteger del daño a las células microbianas
cristales de hielo

Dimetilsulfóxido

Se pueden clasificar en penetrante y no penetrantes

leche descremada
carbohidratos como glucosa, lactosa

Inducen a la deshidratación de las células y debe ser

acompañado por los penetrantes, ayudan a proteger
la membrana celular

En su elección influye el tipo de microorganismo

que se quiera conservar.
b) Conservación por liofilización.

No se da crecimiento en las células

Estabilidad genética es alta, pero no como en la

congelación

Se usan liofilizadores.

Tratamiento complejo : 2 etapas

Este es un método muy recomendable

 Factores que influyen e en la eficacia de la
liofilización
Tipo de microorganismo: Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán
aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos filamentosos

Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del
orden de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos y
levaduras.

Temperatura durante la sublimación

Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.

Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible

Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío
para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo,

Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y

en la oscuridad.
 Los factores que
influyen
liofilización

Se recomiendan
No se debe
Dimetilsulfóxido como
utilizar glicerol
crioprotectores

inositol

la leche
descremada
 Métodos alternativos.

 Son métodos usados cuando no se pueden utilizar métodos de elección.

 Se recomienda usar varios de estos métodos para conservar la cepa.
 Conservación por transferencia periódica.

La cepa se
guarda en forma Es necesario
Existe alternancia
de cultivo activo transferirlas a un
de generaciones
en el medio que medio fresco.
ha crecido.
Disminuyendo la cantidad de inóculo

Rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo.

Inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos.

Almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC.

Alargar los periodos entre siembras.

Para evitar la
desecación se utiliza
aceite mineral estéril.
Utilizar métodos
especiales para
cepas
extremadamente
aerobias.
 Nunca usar cajas Petri.

• Nunca se usar medios de cultivo

selectivos o diferenciales.
 Conservación por suspensión en agua
destilada o en agua de mar estéril
Consiste en suspender Concentración celular
en agua estéril unas no debe ser superior a
Se pueden preparar
cuantas células del 104-105 células/ml en
en criotubos.
cultivo que se quiere el caso de bacterias y
conservar. levaduras.
 Para los hongos filamentosos que no
esporulan, se pueden poner en
suspensión trocitos de agar con el
crecimiento del hongo.
 En el caso de microorganismos marinos,
la suspensión se hace en agua de mar
diluida.
 Métodos Restringidos

Métodos no empleados habitualmente

Microrganismos
resistentes

Liofilización –
Congelación

Rhodospirillum
Spirillum

Paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las
células
 Métodos Restringidos

Conservar Acción se debe a la

microorganismos reducción drásticamente
productores de el metabolismo
esporas protectores
Agentes leche descremada, glutamato sódico al 10%

Producto sellado son higroscópicos

Desecación
Desecación
Desecación Desecación en sal gorda
en suelo,
en papel de en bolitas de para
arena,
filtro. alginato. halobacteria
silicagel, etc.
s.
 Métodos Restringidos

Desecación en papel de filtro

Papel bastante absorbente Whatmann nº 3

Impregna  solución muy densa de células

secar al aire Salmonella y Streptomyces

Procedimiento que se llama desecación

Desecar líquida (L-Dry)

Liofilizador Deseca las células

Evaporación brusca con ebullición o que la

temperatura disminuya demasiado
 Métodos Restringidos

Desecación en suelo, arena, silicagel. Células

protegerán al desecar

microorganismos productores de esporas

Es importante esterilizar el soporte por aplicación de

calor seco

Tierra estéril

inoculada con un cultivo

incubada varios días

esporulación de bacilos
aerobios y anaerobios
 Métodos Restringidos

Desecación en bolitas de alginato EFICAZ

Células Matriz de alginato

Los alginatos son polisacáridos extraídos de algas
pardas, constituidos
Eliminación delpor
agua residuos desucesivas
Hipertónicas ácido 22
desecación al aire (70%)
gulurónico y ácido manurónico. En presencia de
calcio, el alginato puede formar
Tubos cerradosuna estructura
herméticamente
conocida como: “caja de huevos”. En esta
estructura, los iones de calcio se sitúan como
puentes entre los grupos cpn carga negativa del
T°= 4ºC y 18ºC
ácido gulurónico.
Algas
C. vegetales Guardar incluso
a –80ºC
 Métodos Restringidos

Desecación en sal gorda para halobacterias

Célula
s

Desecar espontáneamente

HIGROSCOPICIDAD

Células dejan de
replicarse
Conservación de diferentes grupos
de microorganismos
Algas y Cianobacterias: Características generales:

Conocidas comúnmente como

algas verde-azuladas por su color
Reino: Bacteria División: Cianobacteria
verde-azulado (a veces rojizo, pardo
o negro) y también como Cianofitos.

Se caracterizan por ser:

 Procariotas
 autótrofos
 constituidos por elementos idénticos
aislados (unicelulares) o en cenobios
filamentosos, planos o globulares
 viven en medios húmedos o acuáticos
 entre 1 µm hasta varios micrómetros
Algas y Cianobacterias: Consideraciones generales

subcultivos Crecimiento
seriados a temp necesita luz, ya
entre 10° y que son
15°C. fotosintéticos.

CONGELACIÓN
Las algas no los mejores
toleran bien la resultados se
liofilización ni la obtienen con
desecación. nitrógeno
líquido
Algas y Cianobacterias: técnicas de conservación

Muestras con
Muestras in vivo conservantes

 Vivas y a oscuras en la nevera (4 y 10°C)  Lugol (0,5 ml por 10 mL de muestra )

 Si muestra: elevada densidad de  Formaldehido (2-4%)
organismos y/o MO (diluir)
 Protegidas de la luz y en un lugar fresco
 Tiempo max: 12 h
 <15 °C
 CONSERVACIÓN DE MUESTRAS Y COLECCIONES DE
CIANOBACTERIAS
líquidos como en sólidos especie y de las condiciones de cultivo.

largo plazo congelación a –75ºC

• Se centrifugan cultivos líquidos de entre 50-200ml

1
(tubos estériles)
• los sedimentos : vol final de 1-2 ml.

Dimetil sulfoxido a una [] final del 15% (850 µl de la

muestra más 150 µl del DMSO)
2 añade un crioprotector
glicerol (15%)
• se prepara glicerol al 80% y se esteriliza
• Añadir 190 µl de esta solución a 810µl de la
muestra
 • Mezclar muestra y el crioprotector: tubo de
3 criocongelación
• –75ºC.

Para recuperar las células

• Se rasca una pequeña proporción del material
4
congelado
• se extiende en la superficie de un medio sólido
• se inocula directamente en un medio líquido.

El éxito de la recuperación dependerá del

de las células crioprotector usado
Conservación de Bacterias
todos los métodos conocidos

líneas generales el mejor método es la

liofilización debido a su facilidad de transporte

Congelación

desecación
Conservación bacteriana por método simple a temperatura ambiente

medio semisólido de conservación

Composición, •Caldo corazón 7,5 g

medio de •Agar 3 1,5 g

•Agua destilada csp 300 mL

conservación •pH=7

elaboración del •Pesar las cantidades exactas indicadas y calentar los ingredientes hasta lograr su total
disolución.
medio de •Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min.
•Distribuir asépticamente 3 mL del medio en tubos de 90 x 10 mm
conservación •tapar con tapón de goma previamente esterilizados

método de siembra •Tomar inóculos de las cepas cultivadas, previa comprobación de pureza; sembrar en
del medio de el medio con aguja de nicrón hasta mitad del tubo;
• incubar por 18-24 h a 37 °C y posteriormente mantener a temperatura ambiente.
conservación
Conservación bacteriana por método simple a temperatura ambiente
Conservación de virus

 Se han utilizado todos los

métodos, obteniendo en líneas
generales baja estabilidad.

Nitrógeno líquido
Las cepas que son extremadamente letales y se
utilizan en la investigación o industria

• Retrasar su actividad
Nitrógeno líquido • Mejorar su conservación, evitando
la desnaturalización bioquímica

caro, debe ser monitoreado constantemente y

verificar que no cause daño alguno a la cepa
almacenada
Conservación de virus recombinantes infecciosos

poxvirus, los adenovirus, los virus asociados a los adenovirus

y a los retrovirus

compuesto los virus recombinantes

una solución acuosa
estabilizador entre las infecciosos
con una alta
sales, preferentemente conservados según el
concentración de
monovalentes tales procedimiento de
sacarosa 0,75 M y 1,5 M
como el NaCI o el KCI acuerdo con la

pH básico: 8,5 una sal de un catión invención, se pueden

ganan estabilidad preferible el MgCl2 someter a una
0,5 y 2 mM liofilización.

tampón Tris, las

estabilizar aún más la
soluciones
cápsida o envoltura
trietanolamina,
viral
dietanolamina
 Conservación de Hongos
La conservación de los hongos consiste en mantenerlos viables, eliminando la necesidad
de repiques frecuentes, impidiendo así las mutaciones, una de cuyas consecuencias es la
pérdida de virulencia

desecación y liofilización

Existen dos principios de conservación

donde se reduce el metabolismo se induce la dormancia de las conidias o

esporas

la conservación mediante bajas

el secado sobre sílica gel, la
temperaturas, uso del aceite mineral,
liofilización y el uso de nitrógeno
agua estéril, suelo estéril,
líquido
 Ventajas y Desventajas Congelación Ordinaria

Métodos de elección o de conservación a largo plazo Microorganismos permanecen viables por 2 años
Congelación
No se recomienda para periodos de
almacenamiento mayores
Ventajas Desventajas
Periodos de Requiere aparatos
conservación más largos especiales Congelación Ultrafría

Fallo del sistema = Subida

Estabilidad Genética
de T.
Velocidad de congelación

Resiembras Alto costo

Congelación con nitrógeno líquido

Se logran temperaturas de -150 a -196 C

Liofilización
Ventajas Desventajas
Estabilidad genética Tratamiento más complejo

Comodidad de Microorganismos que

almacenamiento contienen agua en su interior

Células animales, algas y

Envío de cepas
hongos

La mayoría de organismos Daños en las células, tiempo

sobreviven al secado de recuperación

Fase de retardo extendida

Se mantiene a T. ambiente
en el crecimiento

Gram + sobreviven mejor

que las Gram -
Crioprotectores

Protege los microorganismos

durante proceso de
congelación
Reducción de la velocidad de
congelación
Ventajas
Grado bajo de toxicidad para
las células

Evita formación de zonas

intracelulares con alta
concentración de sales

Desventajas Tiempo de exposición de las

células
Métodos Alternativos Método Ventajas Desventajas
Microorganismos Acumulación de
permanecen vivos productos tóxicos
Conservación por Obtención de cultivo Estabilidad genética
transferencia periódica fresco

Hongos filamentosos
Contaminación por
transferencia
Conservación por Altos porcentajes de
suspensión en agua viabilidad
destilada o agua de
mar estéril
Estabilidad genética
Método simple,
económico, seguro
Métodos Restringidos
Ventajas Desventajas

Procedimiento Desecación de células

Desecación en Filtro
sencillo y
Congelación incontrolada
adecuado

Conservar
Desecación en suelo, durante bastante
arena, silicagel tiempo
Hongos y actinomicetos

Desecación en bolitas Conservación de

de alginato algas y células
vegetales
 Consideraciones
Cultivando
en medio
A partir del selectivo.
Método Cuando se crecimiento
empleado en la recuperan para Revitalizarlas trabajar con
conservación nuevos lotes sembrando ellas
en medio
selectivo

No utilizar las No son

células que se adecuadas para
guardaron por pruebas de
estrés laboratorio
Cada microorganismo
soportará métodos de Microorganismos de interés sanitario
conservación mejor
que otros

Se conservan a largo plazo con

métodos generales de congelación o
liofilización
Tomar precauciones
especiales en su
conservación
Para periodos cortos se
mantienen con métodos
alternativos

No existe método
general de
conservación
 Bibliografía

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