Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Medicas

Escuela de Medicina

Cátedra de Inmunología
4to Semestre Grupo:10
Subgrupo 5

Integrantes:
Burgos Holguín Carlos
Macías Conforme Kelvin
Torres Flores María
Zuloaga Ricardo
Docente:
MS. Luis Salazar Rendón
Elisa y Ria
Elisa
Uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, conjugados
resultantes tienen actividad inmunológica como enzimática.

Un componente (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e

insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente).

la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será

fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al
actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable
mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Enzimas:
fosfatas alcalina
peroxidasa de rábano
ß-galactosidasa.
Tipos de Elisa
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sándwich
Doble (DAS)
Heterólogo (HADAS)

Antígeno marcado:
ELISA competitivo
PASOS GENERALES DE UN ELISA.

1.Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.

2. Adición de la muestra problema con la mezcla de

antígenos o anticuerpos.

3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al

anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de
antígeno o anticuerpo no unido.

5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la

enzima.

6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o

anticuerpo.
•7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de
enzima no unida.

•8. Adición del substrato.

•9. Unión del substrato a la enzima.

•
•10. Desarrollo del color
Radioinmunoensayo (RIA)
•Técnica desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow en 1960
para determinar la concentración de insulina en el plasma sanguíneo.
•R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en 1977 (Berson murió en 1972).
•Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran
en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras.
•técnica muy sensible y muy específica. Utilizando anticuerpos de
gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antígeno. (1 pg =
10-12 g).
•Se mezcla una cantidad constante de antígeno
marcado radioactivamente y una cantidad
constante de un anticuerpo para ese antígeno.
•Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y
anticuerpo (Ac).
•se separa la fracción de antígeno que se ha
unido de la que permanece libre (hay varias
formas de hacerlo.
•se determina la radioactividad .

En ausencia de antígeno frio (no radioactivo), todos los complejos Ag—Ac serán radioactivos.
La radioactividad medida es máxima.
•Si la muestra contiene además antígeno frío (no
marcado), éste competirá con el marcado para
unirse al anticuerpo, y se observará un descenso en
la medida de la radioactividad.
•Este descenso es proporcional a la concentración
de antígeno frío en la muestra.
 Es un método de
Cromatografía por purificación que se apoya
inmunoafinidad en anticuerpos unidos a
un soporte insoluble
 Citometría de flujo
Se basa en hacer pasar La generada por la
células u otras dispersión de la luz.
Método rápido objetivo
partículas en
y cuantitativo de
suspensión alineadas y
análisis de células,
de una en una por La relacionada con la
núcleos, etc.
delante de un haz emisión de luz por los
luminoso. fluorocromos
presentes en la célula.
Proceso
 Detecciones
Anticuerpos.

Concentraciones iónicas en el citoplasma .

Potencial de oxireducción.

Estudios del ciclo celular de las células teñidas con sondas

fluorescentes unidas al ADN como el yoduro del propidio.

Células en apoptosis por el uso de sondas fluorescentes como anexina

V, por su unión a los fosfolípidos .
Citometría de flujo moderno
Son capaces de detectar
mínimo 3 señales
fluorescentes de
diversos colores.

Permite analizar la
Miden las propiedades
expresión de muchas
de dispersión
combinaciones de
anterógrada y lateral de
moléculas distintas en
la luz
una célula.
 Citometría de masa

Combina la técnica de
flujo de una sola célula
con la espectrometría de
masa.

Los anticuerpos
específicos frente a las Permite detectar hasta
moléculas de interés se 100 moléculas diferentes
marcan con un metal en una sola masa.
pesado.
 electroforesis

La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al igual

que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de
la constante de ionización de grupos ácidos y básicos.

Para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se

mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso
de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y
separar cuantitativamente distintas especies moleculares; en el caso de
ácidos nucleicos se determina su tamaño, medido en pares de bases.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la

disolución y se determina ópticamente la posición del frente de avance o
frontera con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes
migran a través de un disolvente, utilizando además un medio que da
soporte a éste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el único
objetivo de la técnica es separar los componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para más información, véanse las
pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Estudiaremos únicamente la electroforesis zonal, de uso más extendido.
 Materiales

Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción;
baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y
recuperar, respectivamente, los componentes separados.

Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente

(se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-

agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de
alta porosidad.
 Inmunoelectroforesis

Combina una separación electroforética con una detección por

inmunodifusión.

En orden de aparición, los métodos inmunoelectroforéticos fueron:

Análisis inmunoelectroforético (Inmunoelectroforesis de una dimensión)

Inmunoelectroforesis cruzada (Inmunoelectroforesis cuantitativa en dos
dimensiones)
Inmunoelectroforesis en cohete (Inmunoelectroforesis cuantitativa de una
dimensión)
Contrainmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis de afinidad
 procedimiento

Se suele utilizar un gel de agarosa al 1% con un grosor cercano al milímetro, y

un pH en torno al 8,6. Esto sirve tanto para la electroforesis como para la
reacción con los anticuerpos.

Los complejos de inmunoprecipitación se pueden ver en el mismo gel de

agarosa, pero requieren ser teñidos con colorantes para proteínas tales como
el Azul Coomassie.

En contraste con la electroforesis en gel SDS, la

electroforesis en gel de argarosa permite que las
proteínas estén en forma nativa (estructura
cuaternaria), por lo que la inmunoelectroforesis
permite la caracterización de la actividad
enzimática y la unión a ligandos además de la
separación electroforética.
 Inmunoelectroforesis en sangre

Es un examen de laboratorio que Razones por las que se realiza el examen

mide las proteínas llamadas Este examen se utiliza con más frecuencia
inmunoglobulinas en la sangre. Las para evaluar los niveles de anticuerpos
inmunoglobulinas son proteínas cuando ciertos tipos de cáncer y otros
que funcionan como anticuerpos, trastornos están presentes o se sospechan.
que combaten la infección.
Existen muchos tipos de
inmunoglobulinas. Algunas pueden
ser anormales y deberse a cáncer.

Significado de los resultados anormales

Los resultados anormales pueden deberse a:
Mieloma múltiple (un tipo de cáncer de la sangre)
Amiloidosis acumulación de proteínas
Linfoma (cáncer del tejido linfático)
Insuficiencia renal