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Clase 3-01: Los organelos

celulares y su estudio
• Los organelos
membranosos como
comportamientos
intracelulares
especializados
• Origen evolutivo de los
compartimientos
membranosos
• Fraccionamiento sub-celular
En células
eucariotas, las
membranas internas
forman
compartimientos
cerrados en los
cuales se llevan a
cabo diferentes
procesos
metabólicos
(organelos)
Algunos organelos membranosos en eucariontes
retículo núcleo lisosomas
endoplásmico

mitocondria peroxisoma
Una célula del
epitelio intestinal
endosoma
contiene el set citosol
básico de peroxisoma
lisosoma
organelos que se aparato de
pueden encontrar Golgi
mitocondria
en células
animales retículo
endoplásmico

núcleo
membrana
plasmática
ribosomas
libres
Principales funciones de los organelos membranosos
Compartimiento Función principal

Citosol Contiene variadas vías metabólicas y síntesis de proteínas

Núcleo Contiene el genoma y síntesis de RNA

Retículo Síntesis de la mayoría de los lípidos; síntesis de proteínas


endoplásmico para su distribución a organelos y membrana plasmática
Aparato de Golgi Modificación, destinación, y empaquetamiento de proteínas y
lípidos tanto para excreción como para entrega a organelos
Lisosomas Degradación intracelular

Endosomas Destinación del material endocitado

Mitocondrias Síntesis de ATP por fosforilación oxidativa

Cloroplastos (en Síntesis de ATP y fijación de carbono por fotosíntesis


plantas)
Peroxisomas Oxidación de moléculas tóxicas
Volumen relativo que ocupan los principales
organelos membranosos en una célula hepática
(hepatocito)
Compartimiento % del volumen Cantidad por célula
membranoso celular (aprox.)
Citosol 54 1
Mitocondria 22 1700
Retículo 12 1
Endoplásmico
Núcleo 6 1
Aparato de Golgi 3 1
Peroxisomas 1 400
Lisosomas 1 300
Endosomas 1 200
Los organelos membranosos
evolucionaron de diferentes formas

ribosomas
unidos a
membrana

célula procarionte célula eucarionte


ancestral ancestral

• Las membranas nuclear y del RE habrían evolucionado a


través de invaginaciones de la membrana plasmática
Las mitocondrias se habrían originado cuando un procarionte
fue endocitada por una gran célula eucarionte
célula eucarionte célula eucarionte
ancestral temprana

membrana derivada de célula


célula procarionte aeróbica
eucarionte

• Teoría endosimbiótica del origen de mitocondrias


Durante la etapa G2 del Ciclo Celular ocurre
mayormente la multiplicación y de organelos
membranosos
Las proteínas TRANSPORTE

son importadas a A TRAVÉS DE


POROS
NUCLEARES
los organelos a
través de tres
mecanismos
TRANSPORTE
proteínas A TRAVÉS DE
hechas MEMBRANAS
en el
citosol

TRANSPORTE
POR
VESÍCULAS
La destinación correcta de proteínas depende de
péptidos señales en las proteínas
Proteína citosólica Proteína de RE con
(sin péptido señal) péptido señal removido

péptido señal de
RE unido a
proteína
citosólica

proteína de proteína citosólica


péptido señal de RE
RE con péptido señal de RE

PÉPTIDO SEÑAL CAMBIADO


El estudio de los componentes
celulares

• Microscopía
• Cultivo celular
• Fraccionamiento subcelular
• Enzimas marcadoras de organelos
Muestra de diversos “animálculos” observados por
van Leeuwenhoek utilizando su microscopio simple

(A) Bacteria vista en material que excavó de entre sus dientes


(B) Alga verde eucariótica Volvox, que describió como "nadan
primero hacia adelante y luego hacia atrás" (1692).
Microscopía de contraste de fase

La microscopía de contraste de fase (Frits Zernike, 1934), es


una técnica óptica que mejora el contraste de muestras
transparentes, tales como células vivas (generalmente en
cultivo), microorganismos, cortes delgados de tejido y
partículas subcelulares (incluidos núcleos y otros organelos)
La técnica de contraste de fase emplea filtros que
dan mayor contraste a las pequeñas variaciones
que sufre la luz cuando atraviesa el espécimen

Las células vivas se pueden examinar en su estado natural


sin necesidad de fijarlas o teñirlas, lo que permite el estudio
de procesos biológicos in vivo
Cultivo celular
• El cultivo celular es el proceso de aislar células desde un
animal o planta, para posteriormente crecerlas en un
medio controlado artificialmente
• Las células pueden aislarse directamente desde un tejido
o pueden desagregarse con ayuda de métodos
enzimáticos o mecánicos, o pueden derivar de un cultivo
que ya se ha establecido previamente
• Un clasificador celular
activado por fluorescencia
puede separar células

Las gotitas que contienen


células individuales
reciben una carga
negativa o positiva,
dependiendo de si la
célula es fluorescente o no

Las gotitas son desviadas


por un campo eléctrico en
tubos de recolección de
acuerdo con su carga
Células vivas se pueden aislar mediante
microdisección láser

• Las técnicas de microdisección permiten aislar células


seleccionadas de cortes de tejido. Este método utiliza un rayo
láser para extirpar una región de interés, y permite el
aislamiento incluso de una sola célula de una muestra de tejido
Células vivas también se pueden aislar mediante
perfusión de un órgano
Obtención de células a partir de una biopsia
Células en cultivo

(A) Microfotografía de contraste de fase de fibroblastos


en cultivo
(B) Micrografía de mioblastos en cultivo que muestra
células que se fusionan para formar células
musculares multinucleadas
(C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo
(D) Células de tabaco, de una línea celular inmortal de
crecimiento rápido llamada BY2, en cultivo líquido
Medios de cultivo
amino acids vitamins salts miscellaneous proteins

Arginine biotin NaCl glucose insulin


Cystine choline KCl penicillin transferrin
Glutamine folate NaH2PO4 streptomycin specific growth
factors
Histidine nicotinamide NaHCO3 phenol red
Isoleucine pantothenate CaCl2 whole serum
Leucine pyridoxal MgCl2
Lysine thiamine
Methionine riboflavin
Phenylalanine
Threonine
Trytophan
Tyrosine
Valine
Cultivo primario
• Se obtiene a partir de la disociación de células de un
animal parental o tejido vegetal a través de medios
enzimáticos o mecánicos, y luego las células se mantienen
vivas creciendo en un sustrato adecuado en placas de
vidrio o plástico bajo condiciones ambientales controladas
Cultivo primario
• Las células en cultivo primario tienen el mismo cariotipo
(número y apariencia de cromosomas en el núcleo de una
célula eucariota) que aquellas células en el tejido original
• El cultivo celular primario se puede clasificar de acuerdo al
tipo de células utilizadas en cultivo
Cultivo primario de células adherentes
• Dependen del anclaje a un sustrato (placa de cultivo) para
crecer, y generalmente derivan de tejidos de órganos (por
ej., del riñón o del hígado), en donde las células están
inmóviles e incrustadas al tejido conectivo

Fibroblastos en cultivo sobre una matriz de colágeno


Cultivo primario de células en suspensión
• No requieren de la unión a la superficie de la placa de
cultivo. Todos los cultivos en suspensión se derivan de
células del sistema sanguíneo (por ej., linfocitos de del
plasma)
Células madre se pueden diferenciar en el
laboratorio usando medios de cultivo que contengan
los factores de diferenciación adecuados
Limitaciones del cultivo primario
• Vida útil limitada. No se pueden crecer indefinidamente
• El aumento del número de células agota los nutrientes y
genera toxinas
• Número máximo de divisiones celulares
Líneas celulares

• Como resultado se generan células transformadas que se


pueden dividir casi indefinidamente en el laboratorio
• Se pueden congelar para almacenar y luego descongelar
Algunas líneas celulares
Células HeLa
El uso de anticuerpos marcados con fluorescencia
permite la observación bajo el microscopio de
componentes específicos en una célula o tejido

Fluoresceína
La técnica de la inmunofluorescencia (IF)
puede ser directa o indirecta
La IF permite observar componentes celulares específicos
Los organelos pueden ser estudiados por
separado usando centrifugación
Los tejidos y células pueden ser disgregadas
mecánicamente: HOMOGENIZACIÓN

1) Ultrasonido 2) Detergente suave

Suspensión
de células o
tejido

Si se hace con cuidado,


la homogenización deja
intactos a la mayoría de
3) A través de un 4) Por aplastamiento los organelos
agujero a presión contra las paredes de membranosos
un tubo
El homogenizado celular se puede centrifugar para
separar los componentes más densos de aquellos
menos densos

LA CENTRÍFUGA

Sobrenadante
(componentes más
Homogenizado pequeños y menos
celular (antes de densos)
la centrifugación)
Pellet (componentes
más grandes y densos)

ANTES DESPUÉS
Fraccionamiento subcelular por centrifugación
diferencial
Centrifugación diferencial: BAJA velocidad
Centrifugación diferencial: MEDIA velocidad
Centrifugación diferencial: ALTA velocidad
Centrifugación diferencial: MUY ALTA velocidad
Aquellos componentes que sedimentan juntos
pueden ser separados a través de una
centrifugación en gradientes de densidad

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN

CENTRIFUGACIÓN FRACCIONAMIENTO
muestra
componente de
gradiente de sedimentación lenta
densidad de componente de
sacarosa sedimentación rápida

Recolección de fracciones y
análisis usando enzimas
marcadoras de organelos
Cada componente celular se equilibrará (no seguirá
sedimentando) cuando alcance una posición en la
gradiente que calze con su densidad
EQUILIBRIO DE
SEDIMENTACIÓN

INICIO ANTES DEL EN EQUILIBRIO


EQUILIBRIO
Esta metodología fue
desarrollada por el
Dr. Christian De Duve
(1917 - 2013), quien
obtuvo el Premio
Nobel en 1974
Separación de lisosomas, mitocondrias y
peroxisomas por centrifugación por equilibrio de
densidad

• La fracción rica en
mitocondrias
se separó por
centrifugación en
una gradiente de
sacarosa

Los organelos se
separaron en función
de su densidad
Citocromo
oxidasa
(mitocondrias)

Cada fracción se
analiza respecto a la
actividad de enzimas Uricasa
(peroxisomas)
marcadoras de
organelos (típicas de
un organelo)
Fosfatasa
ácida
(lisosomas)
Conceptos esenciales
• En eucariontes, las membranas internas forman
organelos membranosos
• Los organelos membranosos tienen diferentes
origenes evolutivos
• Los organelos membranosos tienen que
multiplicarse antes de la división celular para ser
entregados a las células hijas
• Los organelos crecen gracias a que sus proteínas
son transportadas desde el citosol al organelo
Conceptos esenciales
• La destinación correcta de proteínas depende de
péptidos señales
• Componentes celulares específicos se pueden
estudiar usando microscopía e
inmunofluorescencia
• Los organelos pueden ser aislados para su estudio
mediante fraccionamiento subcelular
• Cada organelo se puede detectar en las fracciones
midiendo la actividad relativa de enzimas
marcadoras