La lisis celular

• Depende en gran parte de medida del tipo de muestra la cual se va a

procesar.
• Mientras que muestras como sangre, celular, ciertos tipos de tejidos o
saliva se puede alcanzar una suficiente lisis celular en tiempos
relaivamente cortos, en otros tipos de muestrsa como tejidos
incluidos en parafina la lisis celular requiere un tratamiento previo
mucho mas laborios.
• Involucra sacar los componentes desde un compartimento celular:

- Lisis de las células que contienen a los acidos nucleicos

- Incativacion de nucleasas
- Clarificacion: separación de los acidos nucleidos de los restos
celulares.
Uso de la proteinasa K y el dodecisulfato de
sodio
• El procedimiento conocido como PK-SDS por sus sigasle n ingles
Proteinase K – Sodium Dodecyl Sulfate, es uno de los mas usados para
la extracción de AD ya que la digestión de la muestra se puede
realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de
sodio.
• La proteinasa K inactiva las DNAsas, presentes en el lisado celuilar
usando detergente anionico el SDS.
• La proteinasa K también es usada en otros de los métodos para la
digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado celular.
Extraccion con gradientes de cloruro de cesio
– bromuro de etidio
• El ADN genómico puede ser purificado por centrifugación selectiva a través
de la generación de gradientes de cloruro de cesio. En primer lugar se lleva
a cabo el lisado celular por métodos mecánicos o químicos y la mezcka es
cetrifugada durante varias horas en presencia de bromuro de etidio.
• Como hay bromuro de etidio en el medio, se pueden visualizar las
diferentes capas en las que se agrupan los acidos nucleicos según su
densidad con luz ultravioleta. Se obtienen varias capas que pueden
separarse y recuperar el ADN purificado.
• Dicho método a pesar de entregar como resulado un ADN de la alta calidad
tiene una serie de desventajas: es largo, imposible de autimatizar, se vuelve
caro, lo que requiere una ultracentrífuga y usa compuestos químicos
toxicos.
Intercambio anionico para la extracción de
ADN del lisado celular
• La cromotografia en fase solida de intercambio anionico, se basa en la
interaccion que se establece entre los grupos fosfatos cargados
negativamente del ADN y la matriz molecular con que se compacta la
columna.
• Esta interaccion hace que las moléculas de ADN queden retenidas en la
fase estacinaria de la columna y puedan separarse de las proteínas y demás
metabolitos presentes. Luego añadiendo una alta concentración de sales a
la fase móvil se logra eludir el ADN, que si es necesario es precipitado con
alcohol para futuras aplicaciones, si no puede utilizarse directamente
disuelto en el buffer con sales en el que se elude.
• Este método tiene la ventaja de evitar el uso de disolventes organicos
toxicos y es mas simple que los que requieren precipitación de otros
componentes para su separación del ADN.