Análisis del artículo de la

Determinación simultánea de
cafeína y vitamina B6 en bebidas
energéticas mediante HPLC

TANIUSHKA E. DÍAZ MELÉNDEZ

DANIEL TORRES COLÓN
CHEM 430-L
Objetivos

 Determinar la concentración de cafeína y

vitamina B6 en bebidas energéticas para
deportistas.
Técnicas utilizadas

 Los estudiantes universitarios desarrollaron un

método para determinar la concentración de
cafeína y vitamina B6 en Red Bull y otras bebidas
energéticas utilizando HPLC.
Aparatos y Materiales

 Los cromatogramas los recogieron usando un

sistema de HPLC Shimadzu LC-10At equipado con
un detector de matriz de diodos SPD-M10A y una
columna de Pumomenex C18 de 5m de 250 x
6.40 nm.
 EL puerto de inyección estaba equipado con una
inyección de 20 microlitros.
Reactivos

 El Red Bull lo desgasificaron por agitación manual

durante 5 min.
 El hidrocloruro de piridoxina (vitamina B6)(Sigma
Aldrich), la cafeína (Eastman Co), el agua de
grado HPLC de fosfato dibásico(Mallinckrodt)
anhidro de sodio (Fisher Scientific) y el metanol
de calidad HPLC (Mallinckrodt) los usaron tal
como los recibieron.
Soluciones de fase móvil

 El HPLC lo eluyeron con una solución isocrática

de tampón de fosfato 60:40 (v/v) (50 mM, pH 3.0)
y metanol a un caudal de 1.0 mL/min.
 En el HPLC cargaron un depósito con tampón de
fosfato acuoso y otro con metanol de grado
HPLC, y usaron la bomba de HPLC para crear la
mezcla de isocrato.
 Un tercer depósito contenía agua de grado
HPLC; eso lo utilizaron junto a metanol para el
lavado de la columna.
Soluciones de fase móvil

 Prepararon el tampón de fosfato disolviendo

3.525g de Na2HPO4 en 400 mL de agua de grado
HPLC en un vaso de precipitados pre-registrado.
 Una vez disuelto, ajustaron el pH a 3.0 mediante
la adicción de ácido clorhídrico concentrado.
 Transfirieron la solución a un matraz volumétrico
de 500 mL y lo diluyeron a volumen con agua de
calidad HPLC.
Solución estándar
combinada
 La prepararon disolviendo 0.0506g de clorhidrato
de piridoxina (vitamina B6) y 0.1253g de cafeína
en suficiente solución de tampón de fosfato
/metanol 60:40 para alcanzar un volumen de
100.00 mL.
 Obtuvieron una solución madre con 506 ppm de
vitamina B6 y 1253 ppm de cafeína.
Preparación de la
muestra
 Realizaron las muestras añadiendo 10.00 mL de
Red Bull a cada uno de los cinco matraces
aforados de 100.00 mL.
 Añadieron alícuotas de la solución madre a cada
matraz (0.00 mL, 1.00 mL, 2.00 mL, 3.00 mL y 4.00
mL) y llevaron los matraces a volumen con la
solución de tampón de fosfato 60:40/metanol.
Procedimiento de prueba
de HPLC
 Extrajeron una muestra de 100 microlitros y la
inyectaron en el bucle de 20 microlitros para
garantizar el llenado completo.
 La fase móvil consistió en una mezcla de tampón
de fosfato/metanol 60:40 a una velocidad de 1
mL/min.
 Cada ciclo fue seguido por lavados de 90:10
agua/metanol y 90:10 metanol/agua para
asegurar una columana limpia para la próxima
muestra.
Método de análisis HPLC y
condiciones de lavado de columna
Start End Eluent Purpose
Time/min Time/min
0 12 Isrocratic 60:40 Analytic run
phosphate
buffer/methanol
12 13 Linear ramp to 90:10 Column wash
water/methanol

13 16 Flush with 90:10 Column wash

water/methanol
16 17 Linear ramp to 90:10 Column wash
methanol/water

17 20 Flush with 90:10 Column wash

methanol/water
20 21 Linear ramp to 60:40 Column wash
phosphate
buffer/methanol
21 25 Return to isocratic Reset for analytic run
60:40 phosphate
buffer/methanol
Resultados y Discusión

 La vitamina B6 y la cafeína aparecieron en el

cromatograma en aproximadamente 3 y 10
minutos, respectivamente, y ambos ingredientes
tenían una absorción lo suficientemente alta a
292 nm para hacer curvas de concentración
razonables.
 Los estudiantes pudieron ver claramente la
cantidad de solución estándar añadida.
 Las concentraciones de cafeína y vitamina B6 se
determinaron mediante el método de adicción
de estándar.
Resultados y Discusión

 En el Red Bull, las concentraciones de cafeína y

vitamina B6 fueron de 27.2 y 4.22 ppm,
respectivamente, que corresponden a 68.1 y
10.6mg en una lata de 8.3oz.
 El método también se lo aplicaron a las bebidas
energéticas Monster y Rockstar con idénticos
tiempos de retención de cafeína y vitamina B6.
Cromatograma

 Cromatograma que muestra los picos de

vitamina B6 y la cafeína.
Curva de adición

 Curva de adición de estándar muestra la

ecuación de intersección y la extrapolación a la
intersección x.