BIOTENCOLOGIA ALIMENTARIA

PRESENTADO POR:

PEDRO EDILMER SOLARTE DELGADO

CÓDIGO: 108265699

HENRY MACIAS

CÓDIGO: 12122709

BLANCA VIVIANA CAEZ Z

CÓDIGO: 1.085.253.029

KAREN LISETH GRIJALBA RUIZ

CÓDIGO: 1062312351

CEDIEL TENORIO MEZU

CÓDIGO 4661417

TUTOR:

GEOVANNI RUEDA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA

ABRIL DE 2018
 INTRODUCCIÓN

En el presente trabajo se desarrolla el artículo uno (1), purificación y caracterización

de una proteasa aspártica del Rhizopus oryzae extracto de proteasa, peptidasa r, es de
resaltar su utilidad en una diversidad de aplicaciones, además de que el artículo es
preciso en la descripción de una proteasa novedosa aspártico que se purificó a partir
de peptidasa r, una preparación de proteasa comercial derivada de rhizopus oryzae.

Por otra parte para el futuro profesional el artículo es un tema de interés en el campo
de desarrollo tecnológico y económico además del mejoramiento de procesos
tradicionales, que proporcionan herramientas para el uso de enzimas y
microorganismos usados en procesos industriales que conllevan a la creación de
nuevos productos, y de nuevos procesos, donde la biotecnología industrial se plantea
como una alternativa sostenible, que regula el impacto medioambiental de los procesos
biotecnológicos
LA PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEASA ASPÁRTICA DEL EXTRACTO DE
PROTEASA DE RHIZOPUS ORYZAE, PEPTIDAZE R

Aquí se describe la purificación y caracterización de una proteína derivada de Peptidase R con

alta actividad caseinolítica y un perfil de inhibición consistente con el de una proteasa de ácido
aspártico.

Imagen tomada de internet: HTTP://2.BP.BLOGSPOT.COM/-

DIUONI1RFIU/UJLIXPQUB8I/AAAAAAAACD0/WNTH9Q5JIX4/S1600/AMINOACIDOS
-Y-PROTEINAS.JPG
 PEPTIDADAS ASPÁRTICA

Las peptidasas aspárticas (aps) están degradación de proteínas, y como

ampliamente distribuidas, en componentes reguladores para
vertebrados, hongos, plantas, diversas funciones fisiológicas. se
protozoos y retrovirus. son todas utilizan en los alimentos, productos
endopeptidasas y se caracterizan por farmacéuticos, detergentes e
presentar un ph óptimo en el rango industrias biotecnológicas.
ácido y por ser específicamente
inhibidas por pestañita a, están en
muchos procesos fisiológicos,
incluyendo la producción de
nutrientes para el crecimiento
celular y la proliferación, la
 MATERIALES Y MÉTODOS
SE REQUIEREN LOS SIGUIENTES
PRODUCTOS QUÍMICOS:

• CASEÍNA
• PEPSTATINA A
• ACIDO YODOACÉTICO
• Β- MERCAPTOETANOL
• FLUORURO DE
FENILMETILSULFONILO
• N-ETILMALEIMIDA
• PEFABLOC
• CLORURO DE SODIO
• FOSFÁTO DE SODIO.
• DODECILSULFATO DE
SODIO
 METODOLOGIA

1.1. materiales y métodos

Productos químicos

Fluoruro de
Pefabloc SC, N- Acido
Caseína fenilmetilsulfon
La peptidasa R etilmaleimida yodoacético ß-
ilo (PMSF)
se adquirió de mercaptoetanol
Amano Enzyme y ditiotreitol se
Inc. (Nagoya, adquirieron de
Japón). Lipas Sigma-Aldrich
(St. Louis,
MO).

Todos los demás productos químicos y disolventes eran de calidad analítica y se

adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania) y Sigma-Aldrich.
 METODOLOGIA

1.2. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Todas las etapas de

purificación se
realizaron a 4ºC en un
sistema AKTA
Purifier 10 (GE
Healthcare
Biosciences, Uppsala,
Suecia).

La proteína
purificada se
Las fracciones que concentró por
exhiben actividad ultrafiltración
proteasa aspártica usando un
La proteasa dispositivo de
aspártica se eluyó a se combinaron y se
dializaron frente a filtro centrífugo
El sobrenadante se un caudal de 1 ml / Amicon (corte de
min utilizando un tampón glicina-
aplicó a una HCl 50 mM, pH 10 kDa, Millipore)
columna HiTrap tampón de y se almacenó a
equilibrado con un 3,4, para el
Phenyl Sepharose almacenamiento. 4ºC
(GE Healthcare gradiente
Biosciences) descendente lineal
equilibrada con de sulfato de
tampón fosfato amonio del 100%
sódico 50 mM, pH (solución saturada)
7,0. al 0%
 METODOLOGIA

1.3 Determinación del peso molecular y cuantificación de proteínas

Las concentraciones de
proteína se cuantificaron
utilizando un kit de
El peso molecular de la ensayo de proteínas Bio-
proteína se determinó Rad con albúmina de
usando el software suero bovino como
TotalLab (Nonlinear, patrón.
Las proteínas en el gel se
tiñeron con Bio-safe Durham, NC) de acuerdo
Coomassie Blue (Bio-Rad con las instrucciones del
Laboratories). fabricante
La homogeneidad de las
proteínas y el peso
molecular se
determinaron mediante
electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecil
sulfato de sodio (SDS-
PAGE) en geles de
separación de 5% y 12%
de separación, usando
marcadores de proteína de
amplio espectro (6,5-200
kDa; ) Como estándares
de tamaño.
 METODOLOGIA
1.4. secuenciación de aminoácidos n-terminal

La enzima purificada se separó

mediante gel de SDS-PAGE y se
transfirió por electroblotting a
una membrana de fluoruro de
polivinilideno (Millipore) en
tampón de ácido 3-
(ciclohexilamino) -1-
propanosulfónico 10 mM, pH 11,
que contenía metanol al 10%.

La proteína transferida se tiñó

con Coomassi e Blue R-250 y la
banda que contenía proteína
purificada se escindió de la
membrana para la secuenciación
de aminoácidos N-terminal por
degradación de Edman usando un
secuenciador de proteínas ABI
Procise 494 (Applied
Biosystems, Foster City, CA).

http://blast.ncbi.nlm.
La comparación de la secuencia nih.gov/ Blast.cgi
con secuencias codificantes de
proteasa similares en GenBank se
realizó usando la Herramienta de
Búsqueda de Alineación Local
Básica (BLAST) en el sitio web
del Centro Nacional de
Información sobre Biotecnología
(NCBI)

La alineación de secuencias
múltiples y las identidades http://www.ebi.ac.uk/
(%) se realizaron utilizando Tools/msa/clustalo/
Clustal Omega en el sitio web
del Instituto Europeo de
Bioinformática (EMBL-EBI)
 INACTIVACIÓN DE LA PROTEÍNA

• La enzima purificada fue completamente inactivada por el

inhibidor aspártico de la proteasa Pepstatin A.
CONDICIONES DE ACTIVACIÓN DE LAS PROTEASAS ASPÁRTICAS (ENSAYO DE ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA)

• ph ácido (ph 3-5)

• Caseína como sustrato

• La mezcla de reacción: 50 μl de solución de caseína al 2% (p / v), 190 μl de tampón de glicina-hcl

50 mm, ph 3,4 y 10 μl de la concentración apropiada de enzima purificada, se incubó a 35 ° c
durante 30 min.

• La reacción se terminó añadiendo 250 μl de ácido tricloroacético al 10% (p / v).

• La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 12,000 rpm y 4ºc durante 10 minutos.

• La absorbancia del sobrenadante a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro

 METODOLOGIA

1.5. Caracterización enzimática para ph y temperatura óptima

El pH óptimo para la proteasa aspártica purificada se

determinó midiendo la actividad a 35 ° C durante 30 La actividad máxima
min en el intervalo de pH de 2,2-4,0 usando 50 mM observada bajo cualquiera
de glicina-HCl (pH 2,2-3,6) y 50 mM citrato de sodio de las condiciones de
(pH 2,6-4,0) como Tampones de ensayo. reacción documentadas se
definió como 100% y las
actividades relativas se
La temperatura óptima para la actividad proteasa se calcularon una fracción de
determinó mediante ensayos realizados usando este valor.
temperaturas de 15-85ºC durante la etapa de
incubación de 30 min en tampón glicina-HCl 50
mM, pH 3,4
 TERMOESTABILIDAD

• Incubación de la enzima purificada durante 65 minutos en tampón de glicina –hcl 50 mm, ph 3,4, a
35°cy a 45°c.

• A intervalos de tiempo definidos, las soluciones se enfriaron en hielo.

• La actividad residual relativa se expreso como un % de la actividad observada para la enzima no

calentada.
EFECTOS DE REACTIVOS QUIMICOS E IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

• La enzima purificada se incubo cada reactivo en tampón glicina – hcl 50 mm ph 3,4, a 35°c
durante 30 minutos.

• La enzima se ensayó para la inhibición de los inhibidores de serina proteasa pmsf (0,1 mm y
1mm) y peflaboc sc (1mm) y la aspártica inhibidor de la proteasa pepstatina a (1µm)
EFECTOS DE REACTIVOS QUIMICOS E IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

• Para determinar si la proteasa es dependiente del metal, se realizo un ensayo sobre la proteína
purificada después de la incubación con el acido etilendiamino tetraacetico (edta).

• La enzima purificada se incubo a 35°c durante 30 min en tampón de glicina-hcl mm, ph 3,4 con
edta 10 mm.
 EFECTOS DE REACTIVOS QUIMICOS E IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

• El edta se elimino por ultrafiltración centrifuga usando un dispositivo de filtro centrifugo amicon.

• El efecto de los metales divalentes añadidos a la enzima después de la eliminación del quelante con una
solución acuosa de cloruro metalico a una concentración final de 1mm durante 30min.

• La actividad relativa se expresa como un % de la actividad enzimática tratada.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:
• LA HOMOGENEIDAD DE LAS PROTEÍNAS Y EL PESO MOLECULAR SE DETERMINARON MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA-DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) EN GELES DE SEPARACIÓN DE 5% Y 12% DE SEPARACIÓN, USANDO
MARCADORES DE PROTEÍNA DE AMPLIO ESPECTRO (6,5-200 KDA; ) COMO ESTÁNDARES DE TAMAÑO.
• LAS PROTEÍNAS EN EL GEL SE TIÑERON CON BIO-SAFE COOMASSIE BLUE (BIO-RAD LABORATORIES).

• EL PESO MOLECULAR DE LA PROTEÍNA SE DETERMINÓ USANDO EL SOFTWARE TOTALLAB (NONLINEAR, DURHAM, NC) DE ACUERDO
CON LAS INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE.

• LAS CONCENTRACIONES DE PROTEÍNA SE CUANTIFICARON UTILIZANDO UN KIT DE ENSAYO DE PROTEÍNAS BIO-RAD CON
ALBÚMINA DE SUERO BOVINO COMO PATRÓN.
PERFIL CROMATOGRAFICO
CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBA
 RESULTADO Y DISCUSION

• SE DETERMINO QUE EL PESO MOLECULAR APROXIMADO DE LA ENZIMA PURIFICADA ERA DE 39

KDA. ESTO CÁLCULO SE DESARROLLO EN BASE A LA INHIBICIÓN EN PRESENCIA DE LA
PEPSTATINA.

• LA ENZIMA PRESENTA UN PH ÓPTIMO (3,4) Y ESTABILIDAD EN LA TEMPERATURA (35 °C). LO QUE

INDICA QUE ESTA ENZIMA ES APROPIADA PARA USO BIOTECNOLÓGICO Y PARA LA INDUSTRIA
ALIMENTARIA.

• SE EXAMINO EL EFECTO DEL EDTA Y LOS IONES DE METAL EN LA ENZIMA, OBTENIÉNDOSE

COMO RESULTADO, QUE EL EDTA NO TIENE NINGÚN EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
EL Β-MERCAPTOETANOL NO AUMENTO LA ACTIVIDAD DE LA PROTEASA, POR LO QUE SE
DEDUCE QUE ES UN PROTEASA ASPÁRTICA Y ESTO DEBIDO A QUE EL INHIBIDOR DE LA
PROTEASA INACTIVO CUALQUIER ACTIVIDAD DEL ACTIVADOR ENZIMÁTICO.
 CONCLUSIONES

 El avance científico y tecnológico ha permitido establecer que las proteasas son de relevancia puesto que participan
en procesos relacionados con el bienestar del hombre.

 Se pueden dar casos donde la alteración de las enzimas y un mal manejo desencadenan diversas patologías y
trastornos.

 El artículo elegido plantea que aspártico proteasas son una subfamilia de endopeptidasas que son útiles en una
diversidad de aplicaciones .

 Aspártico proteasas son reactivos de mucha utilidad en la industria de procesamiento de alimentos, tema de gran
importancia para la carrera del ingeniero de alimentos.

 Se utilizan como enzimas coagulantes de la leche para la fabricación de queso y como aditivos para mejorar el sabor
de los alimentos y la textura .

 En las industrias de producción de alimentos la mayor parte de las enzimas utilizadas son proteasas por poseer
aplicaciones más prácticas y variadas. En la industria de los alimentos se utilizan como enzimas coagulantes de la
leche para la fabricación de queso y como aditivos para mejorar el sabor de los alimentos y la textura.

 Es importante conocer sobre al purificación de esta enzima, y más que parte de una proteasa que es producida de
forma natural por el organismo, la cual tiene diversas funciones como producción de nutrientes, actúan en el
crecimiento celular y en la degradación de proteínas.