Aplicações Biotecnológicas

da Tecnologia do DNA
Recombinante
Prof. Thiago Maniglia
CRISPR
 O que é CRISPR?
• A CRISPR/Cas9 vem de bactérias estreptococos
• É um mecanismo de defesa antigo e natural encontrado nessas
bactérias.
CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats:
Agrupados regularmente interespaçados de curtas repetições
palindrômicas ”.
• Com sequências únicas entre as repetições que combinam com o
DNA de vírus
O CRISPR é transcrito e o RNA guia se liga a enzima
CAS (proteínas associadas à CRISPR), que podem
cortar precisamente o DNA e eliminar vírus
invasores

RNA guia

Scaffol
d
Formando um complexo capaz de reconhecer e cortar o
DNA de vírus que já infectaram a bactéria
 CRISPR em Eucariotos
• Ferramenta de Edição de DNA
• É possível produzir um CRISPR que se liga em genes eucariontes
• Quando o RNA guia se liga ao DNA eucarioto a CAS corta o DNA e enzimas de
reparo tentam refazer o corte
• Assim é possível gerar mutação pontual que geralmente desliga um gene –
Knock-out
Aplicação no estudo de
doenças como por exemplo
o câncer
• Adicionando modificações precisas de DNA, é possível fazer alterações na
sequencia do DNA

Retirar um erro do DNA e

inserir o trecho correto,
ativando um gene defeituoso
Transgenia
...
Animação
• https://www.youtube.com/watch?v=O3e2_Ctty_M
• https://www.youtube.com/watch?v=1BXYSGepx7Q
 Aplicações do CRISPR
Empresa Crispr Therapeutics: Pedido na União Européia para pesquisa em seres
humanos para tratamento da talassemia Beta. Em 2018 vai entrar com pedido na FDA,
órgão regulador americano, para testar uma terapia contra a anemia falciforme.
Pesquisas Liberadas pela FDA:
 Tratamento de HIV, câncer ou doenças raras;
 Controle ou alteração de micro-organismos que causam doenças infecciosas, como
vírus da zika e seus vetores;
 Melhoria do bem-estar de animais produtores de alimentos, como a criação de
resistência à doenças;
 Alteração de traços específicos de plantas alimentares ou fungos

Exemplo já produzidos: Cães extra-musculosos, porcos que não contraem viroses,

amendoins antialérgicos e trigo resistente a pragas.
Expressão Gênica Heteróloga
 Expressão de Proteína Heteróloga
HETERÓLOGO = Que consiste em elementos diferentes
EXPRESSÃO HETERÓLOGA = significa que uma proteína é
experimentalmente colocada em uma célula que normalmente não
expressa (faz) essa proteína
É uma aplicação da tecnologia do DNA Recombinate
 Vetores de Expressão
• Clona-se o gene de Interesse em um vetor de expressão específico

• Promotor Forte com

região reguladora
• Região de ligação ao
ribossomo – RBS
• Sítio de restrição
• Termino de transcrição
Vetores de Expressão
 Genes Eucariontes podem não ser traduzidos
em hospedeiros procariontes
• Mesmo em vetores de expressão adequados

• Baixa concentração de tRNA específicos

• Falta de processamentos pós traducionais. Ex. Glicosilação

• Deve-se inserir um vetor híbrido (Levedura\Bactéria) em Leveduras

• Ex: Insulina e vacina contra Hepatite B em Saccharomyces cerevisiae

Um Tag pode ser adicionado pra facilitar a identificação
Tag
Tag – Calda de histidina
Exemplos de
TAG
Extração e Purificação
Kits de Purificação de Proteínas
Purificação da proteína de Fusão
• Ex: vetor pGEX4T-1
• Vetor para E. coli com Tag GST (glutationa-S-transferase)
• Separa-se a proteína de interesse fusionada através da cromatografia
de afinidade utilizando-se glutationa-sepharose
• Depois aplica-se protease específica que corta a GTS
 Estratégias para aumentar a eficiência do
processo de produção

Para aumentar a produção é interessante desenvolver um

mecanismo de ativação do gene clonado após fase de crescimento
exponencial
Ex:
 Promotor lac (IPTG)
 Repressor sensível à temperatura do bacteriófago λ
 Aplicações da Expressão Heteróloga

 Produção de proteínas de interesse econômico. Ex: Xilanase, celulase, lipase,

lactase...

 Produção de receptores celulares para testes de absorção de medicamentos

específicos para uma determinada célula

 Anticoagulante TPA

 Hormônios humanos: Insulina, fator de crescimento Fator VIII de coagulação,

Eritropoietina

 Produção de grande quantidade de anticorpos em plantas para imunoterapias.

Ex: IgA