Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Cálculos de energía de la unión de la equinomicina al ADN.
Buendía Buendía Adriana, Meza Castrejón, G. Jesús, Ramírez Rojas Maicky Isaac.
Objetivos
• Permitir la determinación rigurosa y directa de la entalpía de unión entre el péptido
antibiótico equinomicina con el ADN
• Reconocer el papel importante que juegan las interacción intermoleculares entre el
reconocimiento de la equinomicina y el ADN
Introducción
La equinomicina ha proporcionado un conocimiento de los mecanismos generales
mediante los cuales las moléculas pequeñas pueden reconocer el ADN como un objetivo
para efectos biológicos útiles como la unión para el desarrollo de fármacos en
quimioterapia experimental contra el cáncer de rápido crecimiento, en especial leucemia.
Ech se une específicamente al ADN en el surco menor de la doble hélice en secuencias
que contienen al menos dos pares de bases G · C. Interactúa con el grupo purina 2-amino
como un medio para identificar sus sitios de unión preferidos.
Se retiró del ensayo clínico debido a su toxicidad sin un beneficio terapéutico notable.
En el primer informe se observó que la constante de equilibrio para la
unión de la equinomicina al ADN del timo de ternera a baja fuerza iónica
no mostraba una variación detectable con la temperatura, lo que lleva a
la conclusión de que la ∆H debe ser cercana a cero y la reacción
impulsada por un gran cambio positivo de entropía.
 La estimación del error es la desviación estándar de seis determinaciones. A partir de la
fusión del complejo de equinomicina - ADN, la entalpía de la reacción general también se
puede determinar de la siguiente manera:
duplex-equinomicina «2 (cadenas simples) + equinomicina
ΔH2 = 6300 (6600) cal mol-1
 La estimación del error en este caso se deriva de tres experimentos repetidos. La entalpía
para la disociación de la equinomicina del ADN se puede obtener a partir de estos datos
mediante la aplicación de La ley de Hess:
duplex-echinomicina «duplex + echinomicina
ΔH3 = ΔH2 ± ΔH1 = ± 600 (6850) cal mol-1
 Para obtener la entalpía para la asociación entre la equinomicina y el ADN, se debe cambiar
el signo de ΔH3 y se debe dividir por la proporción de unión (rb) utilizada en el experimento
de DSC real. Esto lleva a:
ΔHb = ± (ΔH3 / rb) = ± (± 600 cal mol-1 / 0.16 mol de equinomicina / mol bp) = +3800 cal mol-1
Una vez que se ha determinado la entalpía de unión (ΔHb), se calcula que la constante de unión
al ADN de la equinomicina a 20 ° C es 5.0 3 105 M-1 utilizando la ecuación estándar de van't
Hoff
 Este análisis arroja K = 4.5 x105 M y n = 5.3 pb a 20 ° C. De manera notable e importante, los
valores únicos de K y n pueden con mucha precisión los datos de fusión en un amplio rango
de concentraciones de equinomicina.
Discusión
Representación simplificada de interacciones dipolares de complejos equinomicina con
tetranucleótidos. (AT en Hoogsteen).

Se utilizaron los enfoques combinados de calorimetría de barrido diferencial (DSC) y la • La equinomicina se une al ADN, a 20 °C, con una entalpía pequeña de +3.8 kcal/mol, una
desnaturalización térmica controlada por absorbancia UV, para obtener estimaciones de la energía libre favorable de -7.6 kcal/mol y una entropía de 38.9 cal/molK. Asumiendo
constante de unión del ligando. ΔGcalc=ΔGobs=-7.6 kcal/mol, se obtiene un valor de ΔGint=-12.1 kcal/mol.
Método • Los intercaladores alargan y desenrollan el ADN, aumentando la separación de fosfato
(contraion), proporcionando una contribución entrópicamente favorable a la energía
• El ADN de esperma de arenque se sometió a sonificación, se extrajo con fenol libre de enlace.
y se purificó.
Preparación de
ADN • La energía libre de asociación entre un fármaco y el ADN.

• Se prepararon soluciones de ADN [concentración final 5.0X10-5 M (pb)] que

contenían el antibiótico en proporciones molares conocidas mediante mezcla
directa con partes alícuotas de una solución madre de equinomicina, seguido
de incubación durante 12 horas a 24 ° C para asegurar equilibrio.
Estudios de fusión -1, mientras se
UV • Las muestras se calentaron a una velocidad de 1 ° C min
controlaba continuamente la absorbancia a 260 nm.

• Se utilizó una velocidad de barrido de 1 ° C min-1. Las muestras para DSC de

ADN más equinomicina se prepararon pesando cantidades apropiadas de
antibiótico sólido y disolviendo el material directamente en 2 ml de solución
Calorimetría de ADN 1 mM.
diferencial de • La cantidad exacta de equinomicina unida al ADN se determinó
barrido espectrofotométricamente.

• La constante de unión al ADN de la equinomicina se determinó mediante

estudios de fusión UV. Suponiendo que no hay interacción del ligando con el
ADN derivó la ecuación

Determinación de
las constantes de
unión al ADN • La constante de unión al ADN de la equinomicina a temperaturas más bajas
se estimó mediante el uso de la ecuación de van't Hoff:
Resultados
 La constante de unión para la interacción de la equinomicina con el ADN del esperma de
arenque en un tampón BPE (16 mM de Na + total).
 En ausencia de equinomicina, la temperatura de fusión (Tm) del ADN del esperma de
arenque se midió a 67.7 °C. En presencia de equinomicina 20 mM, una concentración
suficiente para saturar la red del ADN, la Tm se incrementó a 87.7 ° C.
 La entalpía de la fusión del ADN en ausencia de ligando (ΔHm) se determinó por DSC en 6900
cal mol-1 pb. La corrección de estos valores a temperaturas más bajas requiere el
conocimiento de la entalpía de unión al ADN, que se determinó mediante DSC.
Dúplex «2 (cadenas sencillas) ΔH1 = 6900 (6600) cal /mol.
Conclusión
• La equinomicina se intercala en el ADN en dos ubicaciones simultáneamente en una
secuencia específica, inhibiendo así la replicación del ADN y la síntesis de ARN.
• La reacción de unión es claramente impulsado de manera entrópica, proceso estabilizado
por interacciones hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals.
Referencias
Leng, F., Chaires, J. B., & Waring, M. J. (2003). Energetics of echinomycin binding to DNA.
Nucleic Acids Research, 31(21), 6191–6197. http://doi.org/10.1093/nar/gkg826
Chaires,J.B. (1997) Possible origin of differences between van’t Hoff and calorimetric
enthalpy estimates. Biophys. Chem., 64, 15–23.
Wilson,W.D. and Lopp,I.G. (1979) Analysis of cooperativity and ion effects in the
interaction of quinacrine with DNA. Biopolymers, 18, 3025–3041.