INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

MUTAGÉNESIS
“Hidroxilamina como agente mutagénico para
Neurospora crassa”
“Inducción de mutantes en Escherichia coli”

Grupo: 5QM2

Equipo:3 Sección: 1
Gen: Unidad fundamental de
la herencia que ocupa un
locus en un cromosoma
concreto. Secuencia de DNA
que codifica para un
polipéptido.

Cromosoma: molécula de
DNA o RNA que constituye el
genoma. Almacenan la
información genética.

Locus: lugar de un cromosoma

en donde se localiza un gen

Alelo: Formas alternativas de

un gen. Figura 1.Gen Eucariótico
Genoma: Conjunto de genes contenidos en los
cromosomas . Totalidad de la información genética.

Genotipo: Constitución genética de un organismo.

Fenotipo: Propiedades observables de un

organismo controladas genéticamente.

Haploide: Célula u organismo que tiene una sola

dotación de cromosomas .

Diploide: Célula u organismo con dos complementos

cromosómicos.

Merodiploide: Organismo haploide que incorpora

un segmento de DNA del exterior, de manera que
ahora posee dos copias de ese gen.
MUTACIÓN IMPORTANCIA
Cambio de la

secuencia nucleotídica
de una molécula de Análisis genético
DNA que es heredable
y NO se reproduce por
recombinación.
Fuente primaria
de la variabilidad
genética.

Materia prima de
la evolución
Figura 4. Ejemplo de una mutación.
 FRECUENCIA DE MUTACIÓN

 Es el número de mutaciones que aparecen por división celular

en bacterias y organismos unicelulares

 Ejemplo:
Los genes víricos y bacterianos padecen un promedio de
mutaciones espontaneas en 1 de cada 100 millones (10-8) de
divisiones celulares aproximadamente.

 La frecuencia de mutaciones espontáneas es de 10-7 a 10-10 .

Sin embargo, en las mutaciones inducidas aumenta a una
frecuencia de 10-4 a 10-7 .
 POLIMORFISMO GENÉTICO
 Variaciones en una posición o
región específica en la
secuencia de ADN que se
presentan en al menos un 1%
de la población.
Figura 2. Ejemplo de polimorfismo
genético.
MARCADOR GENÉTICO
 Segmento de ADN con una
ubicación física identificable
(locus) en un cromosoma y
cuya herencia genética se
puede rastrear.
Figura 3. Mapa genético de tomate
basado en marcadores morfológicos
NOMENCLATURA DE GENES
En genotipo se escriben las tres iniciales del factor de crecimiento o
enzima de la que se trate con letras minúsculas e italizadas his+ o his -

Antibióticos strs o strr

Enzima conocida hisG+ o hisG-

mutaciones his G 47

Delección D lac pro

Insersión lac::amps

Plásmido his -, arg -/F, lac+

Fenotipo His + o His -

CLASIFICACIÓN

Orígen • Espontáneas
• Inducidas

Grado de • Macrolesiones
lesión
• Microlesiones

Efecto • Silenciosas
sobre el • Sentido equivocado
fenotipo • Sin sentido
 MUTACIONES ESPONTÁNEAS
 Son cambios en la secuencia nucleotídica de los genes y no
parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^-7 a 10^10
(1 en 10 millones)
Errores por tautomerismo.

Daños oxidativos

TAUTOMÉRISMO
 Los cambios tautoméricos pueden resultar en cambios en
el emparejamiento de bases, o mutaciones.

 Ceto-enol en la Timina y Guanina

 Amino-imino en la Citosina y Adenina

Figura 5. Formas normales y tautoméricas de las bases del DNA. La Adenina y
la Citosina pueden existir en la forma amino o en la rara forma imino; la
guanina y la timina pueden presentarse en la forma ceto o en la mas rara enol.
Figura 6. Comparación de las relaciones de emparejamiento de bases normales
con las disposiciones producidas como resultado de cambios tautomericos. Las
puntas de flecha señalan los sitios de unión del azúcar pentosido.
 MUTACIONES POR RADICALES LIBRES
 Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y los superóxidos (O2)
generan rupturas en el enlace glicosídico por la oxidación
del azúcar generando sitios apurínicos o apirimidínicos .

Figura 7.efecto de radicales en bases nitrogenadas.

MUTACIONES INDUCIDAS

 Mutágeno:
agente externo, puede ser físico o
químico, que interactúa con el
DNA causando mutaciones.

 Mutagénesis:
Proceso de formación de un
organismo mutante.

Figura 8. Mutación inducida

por radiación UV
 Rayos UV, X

Humedad

Físicos
Temperatura
extrema
Agentes
Biológicos.
mutagénicos.
pH

Químicos.
 RAYOS X Y RADIACIONES LUZ UV
IONIZANTES:
 Causa la unión o
o Tienen mayor poder de dimerización de pirimidinas
penetración que los rayos UV adyacentes en el DNA.
Siendo los dimeros de timina
o Difícil manejo, por lo que se los de mayor incidencia.
emplean poco en bacterias

o Producen radicales libres de

hidroxilo hiperreactivos,
responsables de la abertura de
un anillo de una base, o
fracturas monocatenarias o
bicatenarias en el ADN, esto
puede ocasionar mutaciones
por deleción .

Figura 9. Dímeros de timina

por radiación UV
CURVA DE SOBREVIVENCIA DE UNA BACTERIA DESPUÉS DE
LA EXPOSICIÓN A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
 TEMPERATURA
 La exposición del material genético a temperaturas superiores
a 37ºC produce mutaciones puntuales en el ADN. Ejemplos
de esas mutaciones son la pérdida de bases púricas, proceso
que se denomina despurinización, o bien desaminaciones,
que consisten en la pérdida de grupos aminos de las bases.

Figura 11. mutaciones inducidas por una alta temperatura

como despurinización (izquierda) y desaminación (derecha)
 BIOLÓGICOS.

 Transposones:

Los transposones son segmentos móviles de DNA.

 Los transposones contienen cortas repeticiones invertidas

terminales que son esenciales para el mecanismo de
inserción y que se utilizan para definir los límites del
transposón.

 Todos los transposones activos contienen al menos un gen

que codifica una TRANSPOSASA, una enzima necesaria para
que se produzca el salto o transposición
Figura 12. Esquema de acción de los transposones
 DESPURINIZACIÓN
 Pérdida de purina en una molécula de doble cadena de DNA,
se produce por rompimiento del enlace glucosídico que une al
carbono 1 de la desoxirribosa a la posición 9 del anillo de purina

Figura 13. Pérdida de una purina en un desoxinucleótido.

Rotura del enlace glicosídico entre la base nitrogenada y el
azúcar al que esta unida con pérdida de una A o una G.

Figura 14. Despurinización por pérdida de una guanina.

 DESAMINACIÓN:
Pérdida de grupos amino.
La C se convierte en U y éste se
empareja con A produciéndose
transiciones: GC→AT.

El U no forma parte del ADN,

la glucosidasa de uracilo se
encarga de detectar U en el
DNA y retirarlo produciéndose
una base apirimidínica.

La 5-Me-C por se convierte en T.

La T es una base normal en el
DNA y no se retira, por tanto estos
errores no se reparan.

Figura 15. Transformación de algunas

bases por desaminación
ANÁLOGOS DE BASES

 Son compuestos químicos que pueden remplazar a

una base determinada. Por ejemplo, el 5-Bromouracilo
(5BU) es análogo de la Timina (T) y puede remplazarla.

 El 5-Bromouracilo puede provocar un error tras la

replicación del DNA, es inestable y provoca
transiciones .
 5-BROMOURACILO

Figura 16. Posibles apareamientos del 5-Bromouracilo.

 2-AMINOPURINA

La 2-Aminopurina (2AP) es análogo de la Adenina (A). La 2AP

aparea con la Timina (T) pero en su forma imíno (2AP*) empareja
con la Citosina (C). Esta alteración produce transiciones.

Figura 17. Posibles apareamientos de la 2-aminopurina

 DESAMINANTES: HNO2
 Provoca transiciones mediante la sustitución de
grupos amino de nucleótidos por grupos ceto, como
consecuencia la citocina de convierte en uracilo, la
adenina en hipoxantina y la guanina en xantina

Figura 18. Sustitución del grupo amino por el grupo carbonilo en una
desaminación con HNO2
Figura 19. Cambios provocados por la desaminación con HNO2
HIDROXILAMINA ﴾HA﴿.
 ﴾NH₂OH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino es
reemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de la
citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones
GC- AT.

Figura 20. Acción de la hidroxilamina en la citosina, provocando

un apareamiento con adenina
ALQUILANTES.
 Etilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones:
transiciones y transversiones.

 Nitrosoguanidina ﴾NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-

nitrosoguanidina : produce transiciones y transversiones
GC→TA

Figura 21. Cambio en el apareamiento de guanina

provocado por la alquilación.
 INTERCALANTES
COLORANTES DE ACRIDINA
 La proflavina y el naranja de acridina son planas, por lo que inician la
mutación insertándose en la doble hélice del DNA, provocando su
deformación; provocando adiciones y deleciones en la replicación.

Figura 22. Moléculas planas policíclicas que se intercalan entre las bases.
Figura 23.Esquema de la acción de
los agentes intercalantes
 Clasificación de mutágenos por su daño, dirección y efecto
Mutágeno Clasificación Daño Dirección Efecto

Luz UV Físico Dímeros de Unidireccional Inserción,

pirimídinas deleción,
sustitución
Hidroxilamina Químico Hidroxilante Unidireccional Transiciones de
GC-AT

Ácido nitroso Químico Desaminante Bidireccional Transiciones de

GC-AT y
trasversiones
AT-CG
EMS Químico Alquilante Bidireccional Transiciones de
GC-AT, AT-GC

5-Bromouracilo Químico Análogo de base Bidireccional Transiciones de

GC-AT, AT-GC

Nitrosoguanidina Químico Alquilante Unidireccional Transiciones de

GC-AT

ICR-170 Químico Intercalante Bidireccional Inserción o

deleción

9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Inserción o

deleción
MUTACIÓN POR GRADO DE LESIÓN
En función de su magnitud, longitud o grado de lesión,
permite clasificarlas en:

Macrolesiones: Microlesiones:
Alteraciones graves Alteración
en la molécula del producida en una o
DNA o en un pocas bases del
segmento grande DNA.
 MICROLESIONES (PUNTUALES)

• Transversiones
• Sustituciones
• Transiciones
• Inserciones
• Deleciones • Alteran el marco de
lectura
 SUSTITUCIÓN
Es aquella mutación en la que donde debería haber una base se
encuentra otra del mismo tipo. Por ejemplo, en lugar de la
citosina se instala una timina.

Figura 22. Esquema de las posibles

transversiones y transiciones
INSERCIONES Y DELECIONES

Este tipo de mutación produce un corrimiento en

el orden de lectura.

Pueden ser:

- Adiciones génicas: Es la inserción de nucleótidos

en la secuencia del gen.

- Deleciones génicas: Es la pérdida de nucleótidos.

 MARCOS DE LECTURA

 ORF: Secuencia nucleotídica organizada en tripletes que

codifica una secuencia aminoacídica de un polipéptido,
incluyendo un codón de inicio y un codón de terminación.

Figura 23. Marco de lectura.

Figura 24. Esquema de las consecuencias de
una deleción y de una inserción en la traducción
CORRIMIENTO DEL MARCO DE LECTURA.

Fig. 25 Mutación por corrimiento del marco de lectura.

EFECTO SOBRE EL FENOTIPO

Mutación Silenciosa:
Son cambios sutiles en las secuencias de DNA,
irrelevantes en un comienzo en cuanto a la
codificación proteínica, que poco a poco van
cobrando importancia siendo determinantes
en la enfermedad y la evolución.

Figura 26. Esquema de una mutación silenciosa donde se

sintetiza el mismo aa.
Mutación Sin sentido
Son aquellas en las que tiene lugar una sustitución
de bases en un codón dado, en donde en vez de
formar otro aminoácido distinto, se crea uno de
los tres codones “stop” (UAA, UAG, UGA).

Fig. 27. Comparación entre

un polipéptido completo y
uno truncado debido a
una mutación sin sentido al
cambiar una guanina por
una adenina. (Tomada de
Snyder & Champness,
2007, p. 157)
Mutación En sentido erróneo
Mutaciones que cambian la secuencia de un codón
dado, sustituyendo una base por otra, lo que puede
producir que el aminoácido codificado no sea el que
se había especificado antes.

Fig. 28. Cambio de una timina por

una citosina en una cadena de
DNA, produciendo una mutación
en sentido erróneo.(Tomada de
Snyder & Champness, 2007, p. 157)
 SELECCIÓN DE MUTANTES.
 Selección de auxótrofos.
Los organismos aúxótrofos son empleados con mayor
recurrencia para buscar un gen específico
defectuoso, motivo por el cual no puede sintetizar sus
factores de crecimiento.

 Selección de protótrofos.
Estos microorganismos son empleados para la
secuenciación del genoma del organismo en su
forma silvestre.
 Selección de microorganismos susceptibles a antibióticos.
Los organismos susceptibles a antibióticos son estudiados
para poder identificar los genes que confieren esta
susceptibilidad y poder seguir posibles resistencias
adquiridas

 Selección de microorganismos resistentes a antibióticos

Son usados para estudio de los genes que confieren esta
resistencia, ya que por medio de dichos estudios se pueden
buscar algunas alternativas de tratamiento.
 MUTACIONES NO REVERSIBLES (UNIDIRECIONALES)Y
REVERSIBLES (BIDIRECCIONALES).

 Si se trata de una mutación unidireccional no

reversible, puede reemplazar al alelo del que se
originó. (A1 A2) pero muy a largo plazo.

 Si se trata de una mutación bidireccional

reversible, se puede establecer una situación de
equilibrio que depende solo de las tasas de
mutación (u) y retromutación (v) (A1 A2).
 REVERSIÓN.
 Es una segunda mutación, se restaura total o
parcialmente el genotipo y/o fenotipo dañado por la
primera mutación.

Verdadera: mutante que a revertido a su genotipo

anterior, restauración del genotipo (ADN) silvestre.

No verdadera (por supresión): reversión del fenotipo mutante

al silvestre a causa de una mutación en otro lugar que
suprima o compense la deficiencia de la primera

• Supresión intragénica: se produce cuando la segunda

mutación se da dentro del mismo gen en que se dio la
primer mutación.

• Supresión intergénica: las segunda mutación se da en un

gen diferente a donde se dio la primer mutación.
ARTÍCULO:

HIDROXILAMINA COMO AGENTE

MUTAGÉNICO DE NEUROSPORA CRASSA

H. V. MALLING
Biology 3' Division,
Oak Ridge National Laboratory),
Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)
(Received June 21st, I966)
Neurospora crassa
o Es un hongo perteneciente a la división Ascomycota

o Es utilizado como organismo modelo por su haploidía, su ciclo

de vida rápido y sencillo, y por la facilidad con la que se
puede cultivar.

o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de la

mutación es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 son
morados y se detectan fácilmente.

Figura 29. Cultivo de

Neurospora crassa.
INTRODUCCIÓN
HA induce sustituciones en pares de bases GC- AT

La reacción entre DNA y HA es con citocina y con

RNA con uracilo

A un pH de 6.1 la reacción es mas rápida con

citocina que con uracilo

HA ha sido usada para inducir daño cromosómico

en células de mamíferos

No se ha podido identificar la alteración por HA en

eucariotes a nivel molecular
OBJETIVOS

 Determinar
la especificidad de HA para
producir reversiones en mutantes
dependientes de adenina.

 Obtener información más detallada

sobre los efectos de HA en Neurospora
Prueba de Ames
 Se basa en la observación de que la exposición de
las bacterias mutantes a las sustancias mutagénicas
puede causar nuevas mutaciones que revierten el
efecto de la mutación original.

Figura 30. Prueba de Ames para observar revertientes.

SELECCIÓN DE MUTANTES.

Figura 31. Selección de mutantes por auxotrofía y Pototrofía

RÉPLICA EN PLACA

Ésta técnica
conocida como
réplica en placa,
(Joshua Lederberg),
es una técnica de
detección que hace
posible determinar
rápidamente si una
determinada cepa
bacteriana es
auxótrofa para
dado metabolito

Figura 32. Técnica de réplica en placa para

selección de auxótrofo a X metabolito.
MEDIO DE CULTIVO Se utilizaron 7 cepas mutantes inducidas con
ácido nitroso y una cepa de origen
espontáneo.

suspendieron
20ml de medio
en solución
glicerol salina (0.9%)
completo con
sulfato de Incubados
adenina 1 día a
30ºC, 6-9
días a 25ºC
Conidios Conidios en
agitación
con perlas Filtrado en malla
Rompimiento de platino
de cadenas

lavados 2
veces por
centrifugación
Resuspender en
solución salina
 Mutantes Ad- 3
La acumulación
difieren de las demás
de tal pigmento
por el desarrollo de
se elimina al
un pigmento
agregar 250 mg
púrpura en el micelio
de sulfato de
y conidios cuando
adenina por
crece en glicerol
litro.
completo

La densidad de suspensiones de conidios se

midió en un fotocolorímetro y el punto
máximo de absorción se encontró a 750µm.
 TRATAMIENTOS
5 min antes de Después de
detener el los
tratamiento. tratamientos
NA, EMS o
ICR-170

Suspensión de conidios
en matraces de
Erlenmeyer en un
agitador rotatorio en
baño de agua a 25º

Todos los tratamientos se

llevaron a cabo con
suspensiones conidiales Resuspender en suspensión
(2X107/ml) en matraces salina mínima de Fries
Erlenmeyer en un agitador ajustada a un pH de 8 con
NaOH.
rotatorio
TRATAMIENTO CON ÁCIDO NITROSO

%S R/ 108 S

Conidios fueron Cf: 0.005M de

suspendidos en NaNO2 y el
0.05M de un tratamiento fue
regulador de inactivado como
acetato de sodio ha sido descrito
pasados los 40
de un pH de 4.5
minutos.
 TRATAMIENTO CON EMS
%S R/ 𝟏𝟎𝟖 S

El tratamiento se
Los conidios fueron inició al añadir
suspendidos en 0.067 M suficiente EMS
de un regulador de para dejar una
fosfatos a un pH de 7.0. concentración
final de 0.1M; el
tratamiento fue
suspendido 300
minutos después.

Abreviaturas: %S= Porcentaje de sobrevivientes

R/𝟏𝟎𝟖 S= Reversiones por cada 108 sobrevivientes
TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA

Los conidios
fueron
resuspendidos
en NaCl 3M

5 minutos antes de detener

Antes del Dilución 5 veces el tratamiento, centrifugó y
tratamiento en la mezcla de decantados y en el tiempo
reacción HA de detener la reacción (300
HA, los conidios minutos después de
fueron concentración iniciado el tratamiento)
suspendidos en final 1M
NaCl 3M

% S R/ 𝟏𝟎𝟖 S

los conidios fueron

resuspendidos en la
solución salina mínima de
Fries ajustada a un pH de 8.
 % S R/ 𝟏𝟎𝟖 S
Tratamiento
con ICR-170

Suspensión de
conidios

Suspender en regulador
de fosfato 0.067M pH 7

Adición de un volumen de
ICR-170 a 49 volúmenes de
suspensión de conidia

Concentración
final de 10.58µM

Tratamiento
terminado
130min.
Después
Procedimiento realizado
en luz Roja, y las cajas
incubadas en oscuridad
ESTIMACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LOS CONIDIOS
TRATADOS Y NO TRATADOS.
 Medios de cultivo
Fueron sembrados en medio mínimo de
Westergaard suplementado con sorbosa
(15g/l), glucosa (0.5 g/l), fructosa (0.5 g/l),
ácido casamino (200mg/l), una solución
vitaminada en glicerol completo (1 ml/l),
y adenin sulfato (25 mg/l)
Para estimar el número de
revertores los conidios fueron
sembrados en el mismo sustrato
usado para los sobrevivientes
anotados pero suplementado con
0.2 mg/l de adenin sulfato en lugar
de 25mg/l de adenin sulfato.
 CONTEO DE REVERTANTES CONTEO DE REVERTIENTES DESPUES
DESPUES DEL TRATAMIENTO DEL TRATAMIENTO CON NA, EMS E
CON HA ICR-170

La densidad de los conidios fue de

2X105 en volumen total de 500ml
Conidios sembrados a una densidad de
106/ml y 2X105 conidios/ml en un
volumen total de 100ml

DETERMINACIÓN DE
SOBREVICENCIA
La densidad de los conidios fue de 5-10
conidios por volumen de sustrato en
volumen total alrededor de 100 mL
 Supresores

SE ANALIZARON 20 DIFERENTES MUTANTES INDUCIDOS EN EL

LOCI AD-3 PARA OBSERVAR LA INCIDENCIA DE SUPRESORES
EXTRAGÉNICOS Y NINGUNO FUE ENCONTRADO.

POR LO TANTO, SE PUDE ASUMIR QUE LA REVERSIÓN POR

SUPRESIÓN FUERA DE LOS LOCUS AD-3A Ó AD-3B SON MUY
RAROS O NO OCURREN.
Alteraciones genéticas inducidas por HA
Tabla 1: Porcentaje de sobrevivientes y frecuencias de
reversión de las cepas después del tratamiento con
ICR-170, NA, EMS e Hidroxilamina.
Grafica 1: Incremento del número de reversiones (M)
después del tratamiento con HA sobre el número de
mutaciones espontáneas (Mo) contra el tiempo de
tratamiento con HA.
Grafica 2: Porcentaje de sobrevivientes contra el
tiempo de tratamiento con HA.
  La frecuencia de reversión con Hidroxilamina no es proporcional al
tiempo en Neurospora, pero sí para fagos.

 Heterocarionte
 Rápida penetración
de HA.
 Reacción con citosina
ocurre en dos pasos

Grafica 3: Cinética de las inducciones de reversiones por HA en la

sustitución par base de la cepa 2-17-155.
Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes contra el
cuadrado del tiempo del tratamiento de HA.
Conclusiones:
 Se obtuvieron 8 veces mas mutantes en las cepas
tratadas con HA que en las espontáneas.

 El porcentaje de supervivientes no fue menor al 42%.

 En Neurospora crassa la Hidroxilamina produce reversión

en las cepas que revierten por sustitución de pb.

 La alteración genética inducida por la Hidroxilamina en

Neurospora es la transición par de base de GC a AT.

 La frecuencia de la inducción por HA sigue una cinética

de segundo orden.
 Práctica 2

Inducción de
mutantes en
Escherichia coli
OBJETIVOS
 Conocer el manejo de algunas técnicas para
producir mutaciones

 Analizar algunos parámetros que caracterizan

el proceso de mutación como la frecuencia
de mutación y la relación dosis-respuesta.

 Caracterizar el daño producido por la luz UV y

HA mediante pruebas de reversión.
 MEDIOS DE CULTIVO
MAC CONKEY MEDIO MÍNIMO LACTOSA
 Medio diferencial  Medio mínimo
 Las bacterias capaces de  Sólo crecen
fermentar acidifican el microorganismos
medio. Se forman capaces de utilizar la
colonias rojas o rosadas. lactosa como fuente
de carbono.

MEDIO LURIA (L)

 Medio rico

Figura 30. Prueba positiva y

negativa de lactosa en
Lac+ Lac- medio Mac Conkey
 CEPA
Escherichia coli
 Se trata de una enterobacteria que se encuentra
generalmente en los intestinos animales, y por
ende en las aguas negras, pero se lo puede
encontrar en todos lados, dado que es un
organismo ubicuo.

 Escherichia coli W3350

 Fenotipo: F-, Gal-, Su-, Sms

DESARROLLO EXPERIMENTAL.
TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA

1 ml

Colectar
células 4000 x g 5 ml
cultivo 10 min medio L
E. coli
W3350

9200 x g
3min
 Tubo [ HA] M
Tapar con
1 0.0 papel
1 ml de 2 0.2 aluminio.
HA pH 6 Incubar a 37°C
3 0.4
en agitación
4 0.6 30 min.
5 0.8

Condiciones
de 9200 x g
esterilidad 3min
1 ml
sol.
Salina
Determinar el
numero de células
viables en cada
tubo con diluciones
decímales
 0.5 ml
Tubo Dilución
0.1 ml
1 10-5, 10-6
2 10-5, 10-6
Sol.
3 10-4, 10-5 salina
10-1 4 10-4, 10-5
4.5 ml
medio L 5 10-4, 10-5
Mac
Conkey

Por duplicado

Incubar tubos Incubar

con dilución 10-1 37°C
37°C 18 h 18 h
DÍA 1. TRATAMIENTO CON LUZ ULTRAVIOLETA
Incubar a 37° con
agitación hasta
obtener una densidad
óptica de 60 unidades
Klett equivalente a
As600nm =1.12 (apróx
Dilución Medio L 4000 x g
15h)
1:20 E. 20 ml 15 min
coli
W3350

500 ul

Resuspender
6 ml Sol.
4.5 ml salina
medio L 10-1
5.5 ml Irradiar por 15, 30, 45 y 60 segundos

0.5 ml

Tiempo de Dilución
irradiación
0 10-5, 10-6
15 10-5, 10-6
Sol. 30 10-5, 10-6 4.5 ml
salina medio L
45 10-5, 10-6
60 10-4, 10-5
0.1 ml

Incubar Incubar tubos

37°C con dilución 10-1
18 h 37°C 18 h
Mac
Conkey

Por duplicado
DÍA 2. CUENTA DE SOBREVIVIENTES Y SIEMBRA PARA SELECCIONAR MUTANTES

Calcular el título
de sobrevivientes y
trazar gráfica de %
de sobrevivencia
vs [HA] o tiempo
NO de irradiación.
picar las
Cuenta de
colonias
sobrevivientes
colonias blancas
Lac-
0.1 ml

Prepara diluciones
10-6, 10-7 y 10-8 De la
Sembrar una caja dilución 10-1 Medio L
de la dilución 10-6 y
dos de 10-7 y 10-8
Mac
incubar a 37°C 18h
Conkey
DÍA 3. REVERSIÓN
Calcular frecuencia de
mutación (FM)
NO
picar las
colonias

Cuenta de
sobrevivientes
colonias blancas
Lac- Elaborar la curva dosis-respuesta,
considerando la dosis del mutágeno
empleadas y las frecuencias de
mutación calculadas.
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE MUTACIÓN PRODUCIDO POR LA LUZ
UV Y HA
0.1 mL

0.5 ml medio L
Agar blando
fundido
Una colonia
aislada Lac-

Medio Mínimo Lactosa

 Papel filtro estéril

Impregnar 20 ul

Estreptomicina y Nitrosoguanidina
Hidroxilamina Nada
9-aminoacridina y 5-bromouracilo

Incubar a 37°C 5 días, observándolas diariamente para registrar la

aparición de revertantes. De acuerdo a los resultados obtenidos y
tomando en cuenta el tipo de lesión que produce cada mutágeno,
proponer que tipo de lesiones produjeron la HA y la luz UV
 BIBLIOGRAFÍA
 Klug W.S. (et. Al.), Conceptos de genética, 5ª
edición, ED. PRENTICE HALL, Madrid (1999)
pág. 411-412, 423-430
 http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pi
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 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/16mutaci
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