DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE

LA TUBERCULOSIS

BACILOSCOPIA
LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN

Blgo. DANIEL FERNANDO ESTRELLA TORERO

• La baciloscopia es la técnica de elección para
el diagnóstico rápido y el control del
tratamiento de la tuberculosis pulmonar del
adulto.
• Es simple, económica y eficiente para detectar
los casos infecciosos.
• Es la herramienta fundamental de un
programa de control de la tuberculosis
 LA MUESTRA

El envase
• Boca ancha: de no menos
de 50 mm de diámetro
• Capacidad entre 30 y 50
ml
• Cierre hermético
• Material plástico,
resistente a roturas.
Número de muestras y momento de la
recolección
 Para Diagnóstico

• Dos o tres muestras por SR, (aumenta

probabilidad de detección).
• La primera muestra debe ser tomada en el
momento de la consulta (muestra inmediata)
• La segunda muestra la debe recolectar el
paciente en su casa por la mañana al
despertar (muestra matinal).
• La tercera muestra, cuando sea requerida
 Para Control

• Una muestra por mes de cada paciente de

tuberculosis pulmonar con baciloscopia inicial
positiva.
• Tomar al menos otra muestra para
microscopía al finalizar el 4º mes (controlar la
evolución del paciente y detectar un posible
fracaso), y una al finalizar el tratamiento para
confirmar la curación.
 Obtención espontánea del esputo
• El primer paso para
asegurar la calidad de
la baciloscopia
consiste en explicar al
SR, con mucha
claridad, la
importancia de
examinar muestras de
esputo, la necesidad
de recolectar esputo y
no saliva.
Calidad de la muestra
• La muestra de esputo
mucopurulenta,
proveniente de árbol
bronquial, es la que
asegura mayor
probabilidad de que
se puedan observar
bacilos
 Calidad de la muestra
• Una buena muestra tiene aproximadamente 3
a 5ml, es generalmente espesa y mucoide.
Puede ser fluida con partículas de material
purulento. El color es variable (blanco,
amarillento y hasta verdoso).
 Otras muestras
• Orina
• Líquido cefalorraquideo
• Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, articular
y otros
• Biopsias
• Pus
 CONSERVACION Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS
• Es conveniente procesar la muestra para
baciloscopía o para cultivo el mismo día de la
recolección. Si esto no es posible, conservarla
siempre en refrigeración (4 °C no congelar) o
en un lugar fresco, protegido de la luz y no por
más de cinco días.
 CONSERVACION Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS
• Utilizar una caja de metal o de
plástico opaco, con algún
mecanismo que trabe su tapa, y
con una manija para facilitar su
acarreo.
• Evitar:
a) Exposición al calor excesivo.
b) Exposición a la luz solar directa.
c) Derrame del contenido del
envase.
 RECEPCION DE MUESTRAS
a) Comprobar que las muestras estén bien
rotuladas (la etiqueta con los datos del
paciente deberá estar colocada en el cuerpo
del envase y no en la tapa) y que
corresponda a lo asentado en la solicitud.
b) Limpiar el envase con fenol al 5% si existe
un pequeño derrame del contenido. Si el
derrame es masivo desechar la muestra por
incineración o esterilización en autoclave.
c) Evaluar la calidad y cantidad de la muestra,
capturar dicha información en el cuaderno
de registro de laboratorio y en la sección
apropiada de la solicitud de baciloscopía.
d) Notificar deficiencias en su identificación,
calidad, cantidad o forma de envío. Si este
es el caso, solicitar una nueva muestra.
LA BACILOSCOPIA
Técnica: Coloración de Ziehl-Neelsen
Fundamento:
• Se basa en la capacidad de las
micobacterias para incorporar y
retener ciertos colorantes (fucsina
fenicada) ante la acción de ácido y
alcohol, propiedad conocida como
ácido-alcohol-resistencia. Debido al
alto contenido en lípidos,
particularmente los ácidos
micólicos de la pared celular.
 Lugar de trabajo y materiales
• Se recomienda que sea un
área exclusiva
Los requisitos mínimos del
laboratorio son:
• Buena iluminación
• Ventanas o extractor para
renovar el aire una vez
finalizado el trabajo.
• Paredes y pisos lavables,
que puedan ser
desinfectados con solución
de hipoclorito de sodio
Lugar de trabajo y materiales
• Una mesa para colocar las
muestras que se reciban y
realizar los extendidos, con
dimensiones mínimas de 1 x
0,50 m, en lo posible cubierta
con material liso y resistente a
soluciones germicidas (fórmica,
acero inoxidable o materiales
similares).
• Un lavadero con fuente de agua y
desagüe, en el que se pueda
lavar las manos y realizar la
tinción.
• Una repisa o armario para los
reactivos, portaobjetos y demás
materiales.
Lugar de trabajo y materiales

• Una mesa para el microscopio.

• Una mesa para escribir los informes y

los registros del laboratorio
 Equipo mínimo necesario
EPP:
• batas o guardapolvos de uso
exclusivo para cada persona que
realice baciloscopia.
• Respirador N95
• Guantes
 Equipo mínimo necesario
• Microscopio binocular con
oculares 10x, 40x y lente objetivo
de inmersión 100x en excelentes
condiciones de funcionamiento.
• Mechero de gas
• Material de vidrio (matraces,
probetas pipetas, etc.).
• Pizetas, embudos, lápiz de punta
de diamante.
• Frascos para soluciones
colorantes y reactivos
preparados.
• Gasa o papel para cubrir el área
de trabajo.
• Envases para muestras.
• Aplicadores de madera.
• Portaobjetos.
• Varillas de vidrio para soporte de
la tinción (puente).
• Hisopos de algodón.
• Soluciones antisepticas: Frasco
con fenol al 5%
• Recipientes para eliminación de
material contaminado.
• Gradillas para láminas.
• Aceite de inmersión.
• Papel lente.
• Papel filtro.
 Reactivos y colorantes
a) Fucsina fenicada.
Para 1000 ml:
Fucsina básica..................................................................3 g
Alcohol de 95 ...............................................................100 ml
Fenol acuoso*………………………………………………………….55 ml
(Completar a 1000ml).
b) Solución decolorante: (alcohol ácido).
Para 1000 ml:
Ácido clorhídrico..............................................................30 ml
Alcohol de 95 ................................................................970 ml
c) Azul de metileno.
Para 1000 ml:
Azul de metileno................................................................1 g
Agua destilada 1000 ml
 Preparación del extendido
“Para este examen se deben usar sólo
portaobjetos nuevos, los rayados o viejos
pueden producir como resultado falsos
positivos.”
 Preparación del extendido
• Ordenar las muestras
• Rotular portaobjetos con el
número único de la
muestra de acuerdo al
orden progresivo del
registro de laboratorio.
• Preparar los aplicadores
 Preparación del extendido
• Para evitar confusiones,
colocar frente al operador
solo la muestra y el
portaobjeto que se va a
procesar.

• Destapar el envase de la
muestra, colocándolo junto
a la laminilla que ha sido
marcada con el mismo
número de identificación
que la muestra
 Preparación del extendido
• Usar un aplicador o palillo
de madera al que
previamente se le ha
quebrado uno de los
extremos (captura el
material mucopurulento y
trasladarlo al portaobjetos)

• Abrir el envase atrás del

mechero y colectar con el
palillo de madera la
fracción útil. (mayor
posibilidad de encontrar
bacilos).
 Preparación del extendido
• Hacer un frotis de 2 cm
de largo x 1 cm de
ancho, haciendo
movimientos circulares
para obtener una
película uniforme
 Preparación del extendido
• No debe ser demasiado grueso
ni demasiado delgado. En ambos
casos se dificulta la tinción y la
lectura microscópica
• Desechar el aplicador de madera
en un frasco que contenga fenol
al 5%. Usar un aplicador
diferente para cada muestra de
esputo aunque sean del mismo
paciente.
• Dejar secar a temperatura
ambiente. Nunca se debe
calentar la laminilla mientras
está húmedo el frotis. Hacerlo
produce aerosoles peligrosos
para el operador.
 Preparación del extendido
• Solo después que el extendido
se ha secado, fijar el frotis
pasando la laminilla sobre la
flama del mechero con suavidad
2 o 3 veces, evitando el
sobrecalentamiento

Fijación deficiente = falso

negativa.

Calentar demasiado = alterar

la estructura de los bacilos.
 Preparación del extendido
• Si es muy grueso, el
extendido puede
barrerse durante el
proceso de tinción.

• Por lo general, cuando

es del grosor adecuado,
se puede leer un
periódico colocado
detrás de un extendido
seco.
 Preparación del extendido
• Al terminar, desinfectar el área de trabajo con fenol al
5% y esterilizar el recipiente con los aplicadores y el
papel o gasa usados sobre la mesa.

• Conservar las muestras hasta terminada la observación

microscópica, en caso de que sea necesario repetir el
extendido, la tinción o la observación al microscopio.

• Solo cuando estos procedimientos se han completado

satisfactoriamente, los contenedores con las muestras
se esterilizan y desechan.
 Tinción

Técnica de Ziehl Neelsen

 Coloración
• Se recomienda teñir como máximo
12 frotis en cada oportunidad para
lograr una coloración uniforme
• Colocar los frotis, conservando el
orden numérico sobre las varillas
de vidrio (distancia mínima
aproximada de 5 mm – 10mm -
para evitar contaminación por
arrastre)
 Coloración
• Cubrir totalmente la
superficie del extendido
con fucsina básica
fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante
con suavidad, sin salpicar
y sin tocar con el gotero.
 Coloración
• Con la llama de un hisopo
embebido en alcohol calentar
suavemente por debajo de los
extendidos, con movimientos
de vaivén, hasta que observe
que se desprenden los primeros
vapores blancos. No calentar
con mechero.
• En caso de derrame del
colorante, reponer la fucsina,
no dejar secar el preparado.
• Calentar tres veces hasta la
emisión de vapores. Dejar
reposar 5 min.
 Coloración
• Enjuagar con abundante agua.
Cuidadosamente la superficie
eliminando totalmente la solución
de fucsina. Girar el extendido y
lavar con cuidado también la parte
posterior
• Inclinar el portaobjetos para
eliminar el exceso de agua (evitar
diluir los reactivos que se
utilizarán a continuación).
 Decoloración
• Cubrir la totalidad del extendido
con solución decolorante y dejar
actuar 3 minutos
• Enjuagar con abundante agua.
• Verificar que el extendido se ha
decolorado (las partes más gruesas
del extendido a lo sumo conservan
un leve tinte rosado). “Si se
observan cúmulos rojos o
coloración rosada intensa, volver a
cubrir con solución decolorante 1-3
minutos” y enjuagar nuevamente.
• Eliminar el exceso de agua inclinando
el portaobjetos
 Coloración de fondo
• Cubrir todo el extendido con
solución de azul de metileno.
• Dejar actuar durante un
minuto.
• Enjuagar las láminas en
ambas caras con agua a baja
presión.
 Coloración de fondo
• Limpiar la parte inferior con
un algodón si ha quedado
coloreada.
• Observar si las láminas
conservan la numeración. Si
no es así volver a numerarlas.
• Dejar secar las láminas a
temperatura ambiente (no
por calentamiento). No
apoyar papel absorbente
sobre el extendido.
OBSERVACION MICROSCÓPICA
Y LECTURA DE EXTENDIDOS
La observación microscópica
debe cumplir principalmente
dos objetivos:

• Determinar si en el extendido
hay BAAR.
• Cuantifica la riqueza en
bacilos.
 Características morfológicas del
bacilo de la tuberculosis
• De 1 y 10 μm de largo.
•Con la coloración de Ziehl
Neelsen se observan como
bastoncitos delgados,
ligeramente curvos, rojo
fucsia, destacándose
claramente contra el fondo
azul.
•Pueden presentarse
aislados, apareados o
agrupados.
 Observación microscópica

A. Colocar una gota de aceite

de inmersión en el extremo
izquierdo del frotis teñido.
B. Enfocar el portaobjetos con
el lente objetivo de 40x
antes de 100x
C. Después de encontrar el
área adecuada, cambiar a la
lente objetivo de 100x.
 Observación microscópica
D. La lente objetivo no debe
tocar el portaobjetos (falsos
positivos).
E.Examinar sistemáticamente
100 campos útiles.
F. Después de observar un
campo microscópico,
desplazar el portaobjetos
longitudinalmente para poder
examinar el campo contiguo.
 Observación microscópica
Campos útiles
•Aquel en el cual se observan
elementos celulares de
origen bronquial (leucocitos,
fibras mucosas y células
ciliadas).

•Los campos sin estos

elementos no deben ser
considerados para contar el
total de campos observados, a
menos que contengan BAAR.
 Observación microscópica
Conteo de BAAR
•Contar el número de campos que
ha leído y el número de BAAR que
ha identificado.

•Se puede utilizar una cuadrícula

de 10 cuadrados por 10 cuadrados,
que representan los 100 campos
microscópicos, como ayuda para
registrar la cuenta.

•En cada cuadrado anotar el

número de BAAR que se observa.

•Si no observa BAAR consignar 0.

Reporte de resultados
Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No.

de campos)
Resultado: (49/100) = 0.49
Entonces: Positivo +
 Reporte de resultados

3 0 5 0 6 7 4 5 0 5

4 0 0 5 7 0 6 0 0 4 Resultado: (No. de bacilos/No.

4 6 0 0 5 7 5 5 0 6 de campos)
0 5 7 5 0 0 6 0 6 0
Resultado: (165/50) = 3.3
6 0 7 0 5 0 6 7 0 6
Entonces: Positivo ++
 Reporte de resultados

15 13 0 9 16 20 10 0 18 15
0 20 15 11 17 16 0 18 20 17 Resultado: (No. de bacilos/No.
de campos)
Resultado: (250/20) = 12.5
Entonces: Positivo +++
Registrar el resultado
Qué hacer si es paucibacilar?

-Leer 100 campos utiles más.

-Si persiste el resultado,
realizar otro extendido de una
porción mas representativa.
-Si persiste el resultado,
anotar el hallazgo y enviar a
cultivo.
-Anotar en el rubro
Observaciones (Ej. 5 BAAR)
-Solicitar nuevas mxs.
Algunas razones que causan resultados
falsos positivos son:
• Error al manejar la muestra o al
registrar la información
•Volver a usar recipientes o
portaobjetos Positivos
•Fucsina Fenicada sin filtrar
•Aceite de inmersión contaminado
•Decoloración incorrecta.
Algunas razones que causan resultados
falsos negativos son:
•Errores al manejar la muestra o al
registrar información
•Mala calidad del esputo
•Decoloración excesiva
•Lectura de menos de 100 campos
microscópicos.
CONTROL DE CALIDAD DE LAS
BACILOSCOPIAS

“Objetivo: elevar y mantener la

calidad de trabajo”.
•El control de calidad permite evaluar si la
información producida por el laboratorio es
precisa, reproducible y oportuna.

•Instaura un sistema de alarmas que permite

prevenir, descubrir y corregir errores

•Resulta más eficaz para detectar y asistir a

los casos de tuberculosis y para controlar la
enfermedad
 Conservación de las láminas:
•Quitar el aceite presionando muy
suavemente sobre ellas un papel absorbente.
•Sumergirlas en un recipiente con xilol o
alcohol 70%, durante no más de 30
segundos.
• Dejar secar al aire.
•Comprobar que la numeración esté visible
en las láminas.
•Guardarlas en cajas para láminas
portaobjetos, o dentro de una caja común
envueltas individualmente en papel, (en
paquetes rotulados con la fecha, en el orden
en que se realizaron).
• Conservarlas en lugar seco y fresco.
 Conservación de las láminas:
Laboratorios que procesan:
-Más de 100 bks por mes y con màs de 10 bks
positivos (diagnostico mas control) conservaran
todas la positivas y las dos negativas siguientes
-Más de 100 bks por mes y presentan menos de
10 bks positivos conservaran además el 10% de
láminas negativas.
-Menos de 100 bks como promedio mensual,
conservarán todas las positivas y negativas del
mes de numeración.
-Si durante el periodo un laboratorio no ha tenido
láminas positivas, conservará todas la láminas del
mes de numeración correlativa.
Evaluación de las láminas:
Calidad de la coloración
Evaluación de las láminas:
Calidad del extendido

Muestras de frotis:
(1)muy chico
(2)no uniforme y
demasiado grande
(3) muy delgado
(4) muy grande
(5)mal decolorado y
muy grueso
(6)tamaño y tinción
adecuadas
Evaluación de las láminas:
Calidad del extendido
Evaluación de las láminas:
Calidad del extendido
GRACIAS POR SU ATENCION

LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN

TELF: 064-217394
CORREO ELECTRONICO:
labreferencial@yahoo.es