TECNOLOGÍA DEL ADN

RECOMBINANTE
 ¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE?
• El término ADN recombinante hace referencia a la
creación de nuevas combinaciones de segmentos o
de moléculas de ADN que no se encuentran juntas
de manera natural.

• La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas

que provienen de la bioquímica de los ácidos
nucleicos unidas a metodologías genéricas
desarrolladas originalmente para la investigación de
bacterias y de virus.
 ¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES?
• Aplicaciones en investigación y medicina
- Producción a gran escala de proteínas de utilidad
médica
- Animales transgénicos
- Terapia génica
• Aplicaciones industriales
• Aplicaciones en agricultura
- Mejora genética de los cultivos
- Nuevos insecticidas naturales
 2 FUNCIONES BÁSICAS
• CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN
• EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR
EL GEN DE INTERÉS)

¿Y CÓMO SE HACE?
 2 ELEMENTOS ESENCIALES
• SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS
• VECTOR
 VECTORES
Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de
una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA

• Inserción de hasta 10kb

1. Plásmidos
• Sistema más común

• Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb)

• Tipo I (T1, capacidad 23kb)
2. Fagos • Lamba (capacidad 25kb)
•P1 (capacidad 100 kb)

• Capacidad de 44kb
3. Cósmidos • Plásmidos con sitios cos

4. BAC • Capacidad de 300kb

• Cromosoma artificial de bacterias
 Células Huésped

Saccharomyces cereviseae,
Levaduras Pichia pastoris, etc.

Células mamíferas Líneas celulares como

CHO ( cél. Ovario Hamster)

GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa)

Bacterias
GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis,
S.aureus, Streptommyces)
 1. Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena
circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas
de origen natural que tienen un origen de replicación
(ori+) y que se replican autónomamente en las células
bacterianas.

¿Porqué son empleados como vectores?

Porque son:
- Pequeños.
- Producen múltiples copias.
LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA
DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS
 PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO

GEN LACZ
(MARCADOR
DE
GEN DE SELECCIÓN)
RESISTENCIA
AL
ANTIBIÓTICO
(MARCADOR SITIO DE
DE SELECCION) CLONADO
MÚLTIPLE

ORIGEN DE
REPLICACION
lacZ
AmpR

ADN foráneo
 GEN LACZ

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

AMPR

PLÁSMIDO DE CLONADO

ORIGEN DE REPLICACIÓN
 PRODUCTO DE PCR

DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y

DEL FRAGMENTO DE ADN CON
LA MISMA ENZIMA DE
PLÁSMIDO DE CLONADO RESTRICCION
 PRODUCTO DE PCR

EcoRI EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
PLÁSMIDO DE CLONADO
 PRODUCTO DE PCR
DIGERIDO CON EcoRI

PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGERIDO CON EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
LIGACIÓN
ADN LIGASA
¿CON QUÉ?

ADN LIGASA
TUBO CON MEZCLA DE
FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON
EcoRI
DOS RESULTADOS
POSIBLES ….
PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

PLÁSMIDO RECOMBINANTE
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

¿CÓMO?

MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO

TUBO CON MEZCLA DE TUBO CON CULTIVO
PLÁSMIDOS LÍQUIDO DE BACTERIAS
RECOMBINANTES Y NO
RECOMBINANTES
 BACTERIA NO
TRANSFORMADA

DOS RESULTADOS
POSIBLES ….

BACTERIA
TRANSFORMADA
 SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB
SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal
INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS
TRES RESULTADOS POSIBLES ….

A. BACTERIA NO
TRANSFORMADA

EN UN MEDIO
CON AMPICILINA

LA BACTERIA SIN
PLÁSMIDO NO CRECE
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

B. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ INTEGRO) ES AZUL
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

C. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
 PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
PARA LA AMPLIFICACIÓN
COMPONENTES: DEL GEN EN BACTERIAS

1. ORIGEN DE REPLICACIÓN
2. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las
bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina)
3. SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
4. PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)
5. SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)
PARA LA EXPRESIÓN DE PARA LA EXPRESIÓN DE
LA PROTEÍNA EN LA PROTEÍNA EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS BACTERIAS

6. GEN REPORTERO
7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las
células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej.
neomicina)
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN
BACTERIAS
 PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN
BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN
 ¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O
DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS?
• Las células bacterianas son extremadamente útiles para la
traducción activa de proteínas de mamíferos,
immunológicamente activas.
• La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita
resolver los problemas siguientes:
1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones
post-tranduccionales.
2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas
bacterianas.
3. los genes eucariotas contienen intrones.
4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas
bacterianos.
5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias
forman cuerpos de inclusión insolubles
6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por
las proteasas de la bacteria y ser degradadas.
EL CASO DE LA INSULINA HUMANA
 SELECCIÓN DEL PROMOTOR

• Según la célula huésped:

- Bacteria
- Célula eucariotas
• Según el tipo de ARN deseado en células
eucariotas:
- ARNm: ARN POLIMERASA tipo II
-ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA
• Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el
plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas
eucarióticos.
• Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha
integrado a uno ó más cromosomas eucariotas.

CO-TRANSFECCION
La co-transfección es la transfección simultánea de varios
plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la
transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se co-
transfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una
reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha
sido bien transfectado.
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
2. FAGOS
¿ Qué son los virus ?
ESTRUCTURA DE LOS FAGOS
FAGOS
ICOSAEDRICOS

FAGOS
HELICOIDALES
 CICLO
LITICO
VS.
CICLO
LISOGÉNICO
 CLASIFICACION DE LOS FAGOS
• El genoma de los fagos puede ser:

- RNA simple cadena (MS2, Qß),

- RNA doble cadena (phi 6),
- DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o
- DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4).

• Los fagos pueden ser:

-líticos,
-temperados o lisogénicos
 PARA PENSAR …..

LOS FAGOS UTILIZADOS COMO

VECTORES
¿SON LÍTICOS O LISOGÉNICOS?
 PLÁSMIDO

FAGOS
3.Cósmidos
 4. BAC
BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME