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Tema: DEFECTOS VISULES Y CORRECCIÓN

Docente: Lic. Avendaño

Escuela Profesional
MEDICINA HUMANA
 CONTENIDO

• CHST6 Detección de Mutaciones y Estrés del retículo endoplasmático en la

distrofia macular de la córnea.
• INTRODUCCION
• RESULTADOS
• DISCUSIÓN
• MATERIALES
RETICULO ENDOPLASMATICO
 INTROCUCCION

La distrofia corneal macular es un raro

trastorno autosómico recesivo que
generalmente se manifiesta en la
niñez o
la adolescencia y se caracteriza
clínicamente por la formación de un
difuso y
fino empañamiento simétrico en el
estroma corneal central que se
extiende
hasta la periferia y eventualmente
involucra todo el grosor de la córnea,
lo
que lleva a una alteración visual
bilateral grave.
 Proliferación de querafocito y apófisis en MCD
QUE SON LOS QUERATOCITOS

Las dos principales funciones son:

Son células predominantes de la  Producen queratina.
epidermis, la capa más  Participan en la barrera contra el
superficial de la piel. agua en la epidermis.
 El grupo MT exhibió un Se realizo un ensayos mostraron que
Los queratocitos WT y MT aumento en el crecimiento de los queratocitos
primarios cultivados Células apoptóticas MCD fue
durante 6-10 generaciones se (muerte celular inhibido significativamente en
utilizaron para el flujo programada). comparación con el normal
Citometría.
Queratocitos.

Se realizo un ensayo
clonogénico
y encontró que los números de
clones en los queratocitos MCD
Se redujeron significativamente.
 Estrés ER en respuesta a mutación de
CHST6
Propusimos que la apoptosis se produjo
por la activación
del estrés ER en los queratocitos MCD.
detectamos la
expresión de GRP78 por Western Blot ,
Queratocitos, en comparación con el
control.
Se verificó la expresión de CHOP, una
proteína clave para
Apoptosis inducida por estrés ER, a
través de Western Blot y
PCR en tiempo real. Los resultados
mostraron claramente que CHOP era
regulado por incremento en los
queratocitos MCD según estadísticas.
 los cambios en Bcl-2 y
Bax se compararon para En contraste con la expresión
verificar si se produjo atenuada de
apoptosis en Bcl-2, el de Bax, una proteína
queratocitos con pro-apoptótica, fue mejorado
los niveles fueron mucho en queratocitos MCD.
más bajos en las células
MCD que en las células
normales
Mutaciones CHST6.
 Cambios histológicos y ultraestructurales
en córneas con MCD

• Por microscopía de luz, el epitelio de las córneas con

áreas de depósito era delgado e irregular.
• Depósitos de sulfato intracelular y extracelular en la capa
subepitelial y el estroma.

• Por microscopía electrónica de transmisión, una gran

cantidad de gránulos densos que no se detectó en el
estroma normal.
Caracterización de los queratocitos MCD.
• Los cambios morfológicos entre
los queratocitos WT y MCD se
analizaron mediante microscopía
de contraste de fase. A través
del análisis comparativo

• Estas anomalías morfológicas a menudo

sugirieron que ciertos cambios patológicos
ocurrieron en los queratocitos MCD debido a las
mutaciones.
 Análisis de ADN
• El examen genético es "el análisis del ARN, los cromosomas (ADN), las proteínas,
y los procesos metabólicos para detectar enfermedades hereditarias,
relacionándose con el genotipo, las mutaciones, el fenotipo, o el cariotipo, con
propósitos clínicos".
 Secuencia de ADN
• La secuenciación de ADN es el proceso
que determina la secuencia de bases de
los nucleótidos (As, Ts, Cs, Gs) de un
fragmento de ADN.
• Para secuenciar un genoma completo
requiere romper el ADN del genoma en
muchos pedazos mas pequeños,
secuenciar dichos pedazos y ensamblar
las secuencias en una única y larga
“secuencia consenso”.
21 pacientes afectados
Se realizo la Se identificación 3
que representan 10
secuenciación del gen mutaciones nuevas y 7
familias genéticas
CHST6 de pacientes previamente informadas.
distintas se inscribieron
con MCD. (tabla1)
en el estudio.

7 tipos de cambios de
base única y 3 cambios
de trama diferentes en la Solo dos eran
región de codificación de homocigotos
CHST6 fueron
encontrados
 Se encontró otra mutación de
cambio de marco después del
codón 20, dependiendo de la
inserción de un par de bases de
adenina (insA) después de la
transversion de timina a guanina
en la posición de nucleótido 62.
Los resultados mostraron una
inserción de un solo par de
bases entre los nucleótidos 290
y 291, lo que resulto en un
cambio de marco después del
codón S98 (P.S98Kfs) (figura
2c).
 Se encontró una mutación Estos cambios dan como
heterocigótica con un resultado un cambio de
cambio de marco y de trama después del codón
nucleótido de base única en 155 (pR155Afs) y una
la familia 6 (denotada la variante de nucleótido de
nueva variante del CG c. base única c.432 C>A
463-464) (p.S144R)

Se encontró c.1072 T>C ,

En las familias 9 y 10, solo
que cambia de tirosina a
se observó un cambio
histidina (p.Y358H)en el
patógeno heterocigoto en la
paciente 9 con manchas
codificación de CHST6
blancas.
 Sofware SIFT Y Afectan la función de la
Probablemente daniños
PolyPhen-2 in silico proteina

En todas las variantes Aminoacidos sustituidos

recién detectadas en el en la variacio de sentido
CHST6 no se erróneo detectada en los
encontraron genes en 50 pacientes eran residuos
cromosomas de control. altamente conservados.
 DISCUSION
Las mutaciones genéticas Enzimas que transfieren grupos sulfato
probablemente afecten la de varias moléculas aceptadoras.
función de algunos genes Intervienen en la sulfatación proteica
post-traducción y en la conjugación del
especialmente en las posiciones sulfato de Compuestos
en la proteína que están Químicos exógenos y Ácidos biliares
altamente conservadas a través
de las sulfotransferasas de
carbohidratos y / o dentro de
dominios importantes que son
esenciales para mantener la
estructura y función de la
proteína.
Diez familias de MCD que participaron en el estudio. Los símbolos abiertos y cerrados
indican individuos no afectados y afectados, respectivamente. Los miembros de la familia
fallecidos se indican mediante barras diagonales, la flecha marca el probando en estas familias.
• El estudio mostro que las mutaciones
en CHST6(La carbohidrato
sulfotransferasa) puede desencadenar
estrés ER( retículo endoplasmatico)
con considerable aumento
de(proteína 78 regulada por glucosa)
GRP78 / CHOP(la proteína homóloga)
y apoptosis celular.
• No hay tratamientos efectivos para
este MCD hereditario, excepto para el
trasplante de córnea.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tripcsina al 0,25%

CCK - 8
Formaldehído al 4% Cristal violeta
kit qPCR RT
 Fluoruro de
RIPA
fenilmetilsulfonilo(PMSF)
Veintiún pacientes de 10 familias no relacionadas
(Figura6)
Recibieron diagnósticos clínicos de MCD por parte de
tres médicos que utilizaron la biomicroscopia con
lámpara de hendidura en el Primer Hospital Afiliado de
la Universidad de Medicina de Harbin.

En este estudio también se analizó la

tomografía de coherencia óptica corneal.

• seleccionaron de 50 individuos sin discapacidad visual

El diagnóstico en cinco familias de pacientes fue MCD tipo I

CHST6 análisis
El ADN genómico se aisló de leucocitos de sangre periférica mediante técnicas estándar.

Tres pares de cebadores. Se utilizaron para amplificar la región del marco de lectura abierto de
CHST6.

Cada reacción de PCR se realizó como una mezcla de:

Reacción que consiste en ADN genómico y de la polimerasa de ADN Premezcla.

Las reacciones de amplificación se realizaron bajo las siguientes condiciones

• 5 min de desnaturalización a 98 ° C seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 98 ° C durante

10 segundos.
• Recocido durante 15 segundos a 55 ° C (para la regiónde codificación central)
• Extensión a 72 ° C durante 45 segundos
• Y una etapa de extensión adicional a 72 ° C durante 7 min.
Microscopía histológica y electrónica de
transmisión de tejidos corneales y queratocitos.

El análisis histológico se realizó en secciones de 4 μm de grosor de botones de córnea

incrustados en parafina de 5 pacientes con MCD no relacionados que se sometieron a una
queratoplastia.

Se utilizaron:
• Hematoxilina y eosina
• Acido periódico de (PAS) y
• Azul de Alcian para teñir los tejidos corneales para el análisis de microscopía óptica.

Además, se prepararon queratocitos y tejidos corneales para un corte fino.

Brevemente, la muestra se fijó con glutaraldehído durante 2 h, se enjuagó con 3 cambios de

solución salina tamponada con fosfato durante 2 h.

Después de lavarse, la muestra se deshidrató en una serie graduada de etanol y se incrustó

en resina epoxi (agar de baja viscosidad),
Cultivo de queratocitos primarios.

Los queratocitos primarios se adquirieron de donantes de tipo salvaje

del Banco de Ojos de la Provincia de Heilongjiang y de pacientes con
MCD

Después de la queratoplastia penetrante o lamelar. Las córneas se

lavaron 3 veces, 15 minutos por vez.

El epitelio corneal, el endotelio,la esclerótica y la conjuntiva se

eliminaron por completo.

Un cuarto de los tejidos de la córnea se cultivaron en placas de cultivo

de suero que contenía penicilina y sulfato de estreptomicina

Los queratocitos primarios se subcultivaron con influencia en medios

que contenían tripsina Y EDTA.