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(PCR)
Tópicos
1. DNA
2. PCR
– Alvos
– Denaturação
– Primers
– Anelamento
– Ciclos
– Requerimentos
DNA
DNA é um ácido nucléico
composto de duas
cadeias antiparalelas
complementares.
Os nucleotídeos são
compostos de um grupo
fosfato, uma pentose e
uma base nitrogenada
DNA
• Acúcar do DNA
– Ácido Desoxirribonucleico
• Açúcar do RNA
– Ácido Ribonucleico
DNA
O DNA tem quatro bases nitrogenadas.
CCGAATGGGATGC
GGCTTACCCTACG
• Padrão complementar
DNA Molecule
Adenina
Timina
Guanina
Citosina
PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é
uma técnica que amplifica uma sequência
específica de DNA, como objetivo de torná-
la abundante e disponível para diversas
técnicas de biologia molecular.
OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as
regiões que flanqueiam a sequência
específica de DNA a ser amplificada, a qual
pode ser um gene inteiro ou somente uma
região pequena.
PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>
e
<. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na
reação de PCR, para que eles se liguem ao
DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem
de novo uma a outra.
PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual
duas sequencias de nucleotídeos são
ligadas através da formação de pontes de
hidrogênio. Na reação de PCR, o
anelamento se dá através da ligação dos
primers com o DNA Alvo, a temperatura de
55°C.
PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a
qual é uma bactéria encontrada
sobrevivendo a altas temperaturas em
geisers no Yellow Stone National Park.
PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA
polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do
anelamento com os primers, na presença de
MG, a altas temperaturas.
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Cycles
PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Extensão: 72°
Número de cópias da
Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar
Protease a
Cada tubo
Adicionar
Tampão de
Lise em cada
tubo
Extração de DNA de células sanguíneas
Realizar
Homogeneização
Criteriosa do
material
Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubos
A 56C por pelo
Menos 10min.
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubos Adicionar etanol para lavagem
para retirar quaisquer e centrifugar de novo.
grumos
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar as maostras em colunas de afinidade e
centrifugar .
Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada
e adaptada em outro tubo
no qual será feita a eluição
Coluna.
•Primer forward - 2 µl
•Primer reverse - 2 µl
•Taq polimerase - 0.5 µl
•H2O estéril - 73.7 µl
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos
Específicos e colocar em termociclador.
Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
Bibliografia
• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts,
Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
forensci_PCR.htm.l
• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html
• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and
Tom Wiggers.
Bibliografia
• Ronald H. Holton, Ph.D.:
– Molecular Diagnostics in the Clinical
Laboratory
– Molecular Biology in the Clinical Laboratory
– Molecular Pathology: Basic Methodologies
and Clinical Applications
– Expanding applications of PCR, by Peter
Gwynne and Guy Page