RESISTENCIA VIH

VIH
 El VIH es un virus de la familia retroviridiae, Subfamilia
de los lentivirus.
 Existen dos tipos de virus VIH-1 y VIH-2, que son muy
similares pero tienen diferencias genéticas.
 Genoma viral de 9.200 nucleótidos
 Se ha demostrado que son virus altamente complejos,
con gran variabilidad genética  Resistencia viral.
 RESISTENCIA VIRAL

La resistencia viral, en sentido amplio se define como cualquier cambio que mejore la
replicación de un virus en presencia de un inhibidor. Sin embargo, estos microorganismos
están provistos de una gran capacidad de adaptación a los cambios introducidos en su
medio natural.

A diferencia de los virus ADN, los cuales son genéticamente más estables, los virus ARN
presentan una elevada tasa de cambios o mutaciones (número de incorporaciones
erróneas por nucleótido copiado) durante el proceso de replicación. La mayoría de los
virus ARN generan variantes virales no idénticas pero genéticamente muy cercanas,
denominadas cuasi-especies, las cuales se hayan sometidas a un continuo proceso de
variación, competición y selección. Tal es el caso del virus de inmunodeficiencia humana
(VIH), el cual se caracteriza por presentar altos niveles de replicación (1010-1011 partículas
virales producidas por día) y una elevada frecuencia de aparición de mutaciones (3x10-5
pares de bases por ciclo de replicación), originando la formación y selección de diversas
cuasi especies virales.
 La retrotranscriptasa carece de actividad exonucleasa 3'-> 5', que actúa como
correctora de errores.
 Tanto las proteínas estructurales como aquellas con actividad funcional poseen
una notable plasticidad.
 El virus presenta una alta tasa de replicación, que permite generar del orden de
1010 "nuevos" viriones cada día.
 Está bien documentado que en un determinado momento coexisten en cada
persona infectada todas las posibles variantes del VIH ("cuasiespecies").
 la resistencia del VIH consiste en un fenotipo alterado como resultado de un
cambio en el genotipo viral que se puede detectar tanto in vitro como in vivo.

RESISTENCIA RESISTENCIA
PRIMARIA SECUNDARIA

cuando se encuentran en cuando aparecen en la

virus de pacientes que no
han sido tratados
previamente, lo que
implica que la infección
se ha adquirido a partir de
cepas de VIH-1 resistentes
población viral de un
paciente como
consecuencia de la
presión selectiva ejercida
por la exposición a
fármacos antirretrovirales
• Cuando la gp120 se une a la
molécula CD4, se produce
un cambio conformacional
en la envuelta del virus que
expone un dominio
específico de la gp120 capaz
de unirse, según la afinidad
de env, a uno de los 2
correceptores de
quimiocinas, CCR5 o CXCR4,
que se encuentran en la
superficie de la membrana
celular.
 CORRECEPTORES MÁS
IMPORTANTES PARA EL VIH

CXCR4: En células de la serie mieloide,

CCR5: En monocitos, macrófagos, células
linfoide, así como en epitelio y endotelio.
B, y T. Este receptor pertenece a la familia
Pertenece a la familia de los receptores de
de receptores de las beta quimoquinas y es
las beta quimoquinas. Su principal función
una proteína unida a proteína G. Su
es ser receptor así como producto
función es ser receptor y una sustancia
quimiotáctico para células T, como
quimioatrayente, además es correceptor,
correceptor con el CD4 para subtipos del
+
junto con el CD4+, para algunos subtipos
VIH con tropismo para células T y formas
de VIH con tropismo para macrófagos.
adaptadas por cultivo en laboratorio.
 Los fármacos antirretrovirales, especialmente cuando se utilizan en concentraciones
subinhibitorias, seleccionan mutaciones asociadas a resistencia como consecuencia de la
alta variabilidad del virus. En la actualidad, el fenómeno de resistencia a drogas
antirretrovirales es uno de los principales aspectos de interés en la terapia de la
infección por el VIH.
 Existen dos tipos de mutaciones: primarias y secundarias. Se conocen como mutaciones
primarias aquellas alteraciones en el material genómico que una vez expresadas darán
lugar a cambios en el sitio activo de la enzima, dado que afectan a la afinidad de ésta
por su sustrato. Habitualmente se seleccionan pronto en el curso del tratamiento por la
presión selectiva ejercida por el fármaco, en un intento de evadir su acción inhibidora.
Las mutaciones secundarias se van acumulando en el genoma viral que ya posee
mutaciones primarias con la finalidad de restaurar la ventaja cinética que ha pagado
la enzima por la mutación primaria.
 En general, se debe sospechar la presencia de resistencia farmacológica cuando
los niveles de carga viral empiezan a aumentar (0,5 log), o si se hacen
detectables en mediciones repetidas cuando previamente eran indetectables.

 Las pruebas de detección de resistencia antirretroviral ofrecen los siguientes

beneficios clínicos: 1) aumento de la probabilidad de supresión viral y 2) menor
morbilidad de los pacientes tratados para la infección crónica por VIH.
INDICACIONES:

 Actualmente existen numerosas guías nacionales e internacionales que describen

las circunstancias en las que se aconseja un estudio de resistencia pero en general,
dichas guías coinciden en la recomendación de realizar el estudio de resistencia
antes de comenzar el tratamiento antirretroviral, sea una infección reciente o
crónica, tras el fracaso terapéutico, en embarazo o tras una exposición accidental
al caso fuente si no lo posee.

 No se recomienda tras suspensión del tratamiento por la reversión de la mayoría

de las mutaciones que no se detectarían al ser variantes minoritarias.
 • consisten en un sistema de replicación in
vitro que enfrenta al virus con diferentes
FENOTIPICAS concentraciones de fármacos
antirretrovirales.

• se basan en el análisis del genoma y por

tanto detectan la presencia de mutaciones.
GENOTIPICAS • tienen mayor difusión entre los laboratorios
de diagnóstico.
RECOMENDACIONES:

 Antes de tomar la muestra para una prueba de detección de resistencia se requiere

estar seguro de que el paciente continúa bajo el tratamiento que supuestamente ha
fracasado. Algunos autores recomiendan que el plazo máximo transcurrido entre el
cese del tratamiento y la detección de resistencias no supere los quince días, pues el
rápido recambio de la población viral conduciría a un predominio de cepas virales
salvajes que daría lugar a falsos negativos en la determinación de resistencias.
Además, se requiere de un umbral de carga viral mínimo para garantizar la obtención
de resultados fiables, establecido generalmente en mil copias de ARNviral por
mililitro.
 Las pruebas genotípicas se basan en el análisis de la estructura
genética viral, obtenida de aislados del VIH de muestras de plasma
y por tanto detectan la presencia de mutaciones en el genoma
asociadas a resistencia a drogas antirretrovirales.
 Determinan las mutaciones en la secuencia primaria de nucleótidos
del gen del VIH objeto de estudio comparándola con la secuencia
de una cepa salvaje.
 Existen tres pruebas genotípicas comerciales: la secuenciación y dos
técnicas basadas en la hibridación: LIPA y GeneChip
 El código genético de la muestra del virus es comparado con el código del virus tipo
salvaje. El código es una larga cadena de moléculas llamadas nucleótidos. Cada grupo
de tres nucleótidos, llamado “codón,” define a un aminoácido particular que se utiliza
para construir un nuevo virus.
 Las mutaciones son descriptas usando una combinación de números y letras, K103N por
ejemplo. La primera letra (K) es el código para el aminoácido en el virus tipo salvaje. El
número (103) identifica la posición del codón. La segunda letra (N) es el código para el
aminoácido que “cambió” en la muestra mutante.
 Los análisis genotípicos cuestan alrededor de $250. Los resultados están listos en
aproximadamente dos semanas. El análisis genotípico es el método preferido para
quienes tienen problemas con su primer o segundo régimen de medicamentos.
RECOMENDACIONES:
 No ordene pruebas de genotipificación en pacientes con problemas
activos de incumplimiento, intolerancia, o inconsistencia en la toma de
medicamentos (III A).

 Siempre confirme fracaso virológico y carga viral mayor a 1000 copias

antes de ordenar una prueba de genotipificación (II A).

 La prueba de genotipificación debe realizarse en pacientes que se

presentan con un segundo o tercer fracaso terapéutico previa
autorización de experto en enfermedades infecciosas o VIH-SIDA (I B).
 La prueba de genotipificación debe interpretarse con la
participación de un experto en enfermedades infecciosas o en
VIH-SIDA (I B).

 La conducta que se derive de la información de las pruebas

de genotipificacion debe ser siempre supervisada por un
experto en enfermedades infecciosas o en VIH-SIDA (IIIA).

 El paciente debe estar consumiendo el régimen que fracasa

en el momento en que se le toma la muestra para la prueba
de genotipificación o dentro de las dos a cuatro semanas
posteriores a su suspensión (II B).
 La técnica más empleada para la detección de mutaciones de resistencia es la
secuenciación poblacional del genoma que codifica las enzimas transcriptasa
inversa, proteasa o integrasa. Antes de la secuenciación es necesario extraer el
ácido nucleico del plasma del paciente, transcribirlo en ADN (retrotranscripción) y
hacer al menos una reacción de amplificación (PCR). Una vez realizada la reacción
de secuenciación, el procedimiento de lectura se encuentra automatizado
mediante electroforesis acoplada a la detección de dideoxi-nucleótidos
(terminadores de cadena) fluorescentes. Tras la obtención de la secuencia es
necesario un análisis informático para comparar las secuencias obtenidas con una
cepa de referencia para establecer las mutaciones encontradas relacionadas con
resistencia a antirretrovirales. Algunas de las compañías que han desarrollado
reactivos y equipos de secuenciación automática para esta aplicación son
TruGene® HIV-1 Genotyping Test (Siemens) y ViroSeq® HIV-1 Genotyping System
(Abbott Diagnostics). El primero emplea la secuenciación bidireccional y la
electroforesis en gel, mientras que el segundo emplea el método unidireccional y la
electroforesis capilar. Ambos sistemas ofrecen un software para la edición de las
secuencias y un algoritmo propio de interpretación.
 Las técnicas de secuenciación, comerciales o “caseras” aseguran un 98-100%
de éxito en la amplificación en muestras con una carga viral superior a 500-
1.000 copias/ml, sin embargo, con las adecuadas modificaciones es posible
amplificar prácticamente cualquier muestra con carga viral detectable.
 La secuencia obtenida por estos métodos de secuenciación poblacional es
en realidad la secuencia promedio de todas las variantes presentes en la
muestra original, siendo difícil detectar mutaciones que supongan menos del
10-20% del total. Esto explica por qué los métodos que utilizamos predicen el
fracaso de un fármaco pero no aseguran el éxito, ya que las mutaciones
pueden encontrarse por debajo de estos niveles (variantes minoritarias), y
pueden ser seleccionadas cuando se emplea el fármaco al que confiere
resistencia. Para asegurar la detección de las variantes que representan
menos del 20%, se debe de recurrir a técnicas especiales: clonación de los
productos de amplificación, PCR mediante diluciones límite o PCR-alelo
específica a tiempo real, que no son aplicables hoy por hoy a la rutina del
laboratorio de diagnóstico clínico.
 LiPATM
El fundamento de esta técnica es una hibridación reversa post-PCR (46, 47). El soporte de la
hibridación consiste en tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucleótidos específicos
inmovilizadas en líneas paralelas. Estas sondas son complementarias a la secuencia de
mutaciones conocidas que confieren resistencia a los fármacos antirretrovirales (43, 48). La
amplificación de la muestra se realiza con iniciadores biotinilados que permitirán el revelado
de la reacción. Tras la hibridación se añade un conjugado compuesto por estreptavidina-
fosfatasa alcalina, que se unirá a cualquier híbrido formado sobre la tira. Al añadir el sustrato
de la enzima se producirá un precipitado marrón-púrpura en las posiciones
correspondientes.
 GeneChipTM
A pesar de que el fundamento de esta técnica es una hibridación, el resultado final es la
secuenciación del material amplificado a partir de la muestra. El soporte de hibridación son
"chips" de sílice que contienen un "biblioteca combinatoria" de sondas, que consiste en una
gran cantidad de oligonucleótidos solapantes (409.000/1,28 cm2). La hibridación en
microarrays va a permitir identificar el nucleótido presente en cada posición de la secuencia
a analizar. Puesto que los productos de RT-PCR están marcados, la detección de
fluorescencia tras la hibridación mediante barrido de láser e integración de las señales
obtenidas con un programa informático permitirá deducir la secuencia. Una ventaja de esta
técnica es que permite el análisis simultáneo de un elevado número de muestras.
 Dado que las pruebas genotípicas son una medida indirecta, pues la presencia de
mutaciones no siempre implica su expresión, las pruebas fenotípicas deberían ser
el primer escalón natural en la detección de resistencias.
 Clásicamente estas técnicas consistían en el cocultivo de linfocitos del paciente con
líneas celulares linfoides, en presencia de fármacos antirretrovirales.
Transcurridas unas semanas se medía la replicación viral por la producción de Ag
p24 o la actividad retrotranscriptasa. Estas técnicas tienen varias limitaciones e
inconvenientes, como son la laboriosidad, el alto coste, la infraestructura
necesaria, el largo tiempo requerido y la falta de estandarización. Todo esto ha
sido solventado en parte por las técnicas de virus recombinantes.
 Las técnicas de virus recombinantes determinan la concentración que inhibe el
50% de la infectividad (IC50), y la comparan con la IC50 de una cepa de referencia
o de un aislamiento anterior de un mismo paciente. Existen dos técnicas
comerciales que se diferencian principalmente en los siguientes aspectos:
- Sistema de producción del virus recombinante.
- Mecanismo de detección de la replicación viral.
- Valor umbral de carga viral requerido.
- Tiempo de realización.
- Cepa de referencia.
- Punto de corte.
¿Qué es mejor?

Fenotipo real:
- Prueba real
- Alta variabilidad intraprueba
Costo !!

Genotipo:
- Interpretación compleja

Fenotipo virtual:
- Medida de probabilidad estadística
- Mayor precisión
- Problema en la definición de veces
significativas: biológicos y clínicos
“
GRACIAS
”