UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO

VILLAREAL

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ASOCIADAS AL PASTO VETIVER (Chrysipogon zizanioides) PARA EL

PROCESO DE FITOREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS
Saul Barrientos,Freddy Cruz, Reyna Espinoza,Rogger Julca,Jacky Lucio, Diana Tomas/Mg. Gisela
Yupanqui/Laboratorio de CC.NN UNFV

Problema Materiales Resultados

Materiales Cantidad
¿Cómo identificar las bacterias endófitas Aislamiento de nódulos de Rhizobium
asociadas al pasto Vetiver (Chrysopogon Agar nutritivo 15 ml

zizanioides) para el proceso de fitorremediación Carbonato de calcio (CaCO3) 5 ml

Suero fisiológico 5 ml
de suelos contaminados con hidrocarburos Placa Petri 3 unidades
ACPM (SPIRAX)? Asa de Kolle 1 unidad
Espátula de drigalsky 1 unidad
Mechero de Bunsen 1 unidad
Materiales de la columna de Winogradsky

Pica pica (papel picado) 200 g

Hipótesis Cascara de huevos

Hojarasca (hojas secas)
12 unidades
300 g
Tiza molida 5g
Suelo contaminado con hidrocarburo 400 g
• Hipotesis general Sulfato de Calcio 10 ml
Materiales Tinción de GRAM
Si se identifica las bacterias endófitas asociadas al Cristal violeta o violeta genciana 1 gota
pasto vetiver (Chrysopogon zizanioides) durante el Alcohol cetona 1 gota

proceso de fitorremediación, entonces se podrá Lugol 1 gota

tratar los suelos contaminados por hidrocarburos
ACPM (SPIRAX)
• Sub hipótesis
Si se describen los tipos de métodos para identificar
bacterias, entonces se podrá identificar y
determinar la presencia de estas durante el proceso
de fitorremediación de suelos contaminados por
hidrocarburos.
Descripción general del
proyecto
El trabajo de investigacion tiene la finalidad de
identificar las bacterias endófitas asociadas al pasto
Vetiver (Chrysopogon zizanioides) para tratar
suelos contaminados por hidrocarburos mediante el
proceso de fitorremediacion . La fitorremediacion es
una estrategia biológica que puede ser utilizada
para facilitar la recuperación de suelos afectados
por diferentes contaminantes. Este tipo de
tecnología utiliza las plantas y sus microorganismos
asociados, para eliminar los contaminantes del
ambiente o reducir su impacto. Para identificar las
bacterias se realizaron los métodos de Aislamiento
de Nódulos de Rhizobium y Columna de
Winogradsky,asi como la coloración Gram.
Safranina
Aceite de cedro
pHmetro digital
Procedimiento
EXPERIMENTACIÓN COLORACION DE GRAM
DE SUELO CON HIDROCARBUROS
•Retirar las láminas (2) enterradas en la
columna de WINOGRADSKY
•Elegir la cara que se utilizará y limpiar la que
no se utilizará para facilitar la observación en el
microscopio.
• Fijar con fuego de mechero por aprox. por un
minuto y retirar.
•Agregar cristal violeta (violeta de genciana
C24H28N3Cl) por un minuto y retirar con agua
el exceso.
•Agregar lugol (Yodo) por 1minuto y quitar con
agua el exceso.
•Adicionar Alcohol cetona y mover en forma
circular por 30 segundos luego retirar el exceso
con agua.
•Agregar safranina por un minuto y secar.
•Finalmente agregar aceite de cedro para lograr
un mejor reconocimiento y observar
DETERMINACIÓN DEL PH
•Retirar suelo adyacente a las raíces
•Secar por 48 horas o acelerarlo con estufa
•Tamizar la muestra de suelo
•Tomar 10 gramos de suelo
1 gota
1 gota
1 unidad • A través de la columna de winogradsky y la
tinción gram se encontró las bacterias gram
nevativas que presenta un colo rojo.
• Mediante el aislamiento de los nódulos no se
llegó a ningún resultado.
• A través del análisis del pH del suelo se obtuvo
COLUMNA DE WINOGRADSKY los siguientes resultados: muetra control
(pH=8,00), muestra con hidrocarburo antiguo
(pH= 7,97), muetra con hidrocarburo nuevo
(pH=8,16)
•Retirar suelo de las zonas más cercanas a la
Conclusiones
raíz entre 200 o 300g
•Ingresar pequeñas capas de suelo (retirado en
la columna), tiza molida, superponer papel
picado, hojas secas, cascara de huevo, cubrir y
hacer una nueva capa de suelo.
•Para finalizar se agrega SO4Ca (en forma • A través de la coloración gram y la columna de
circular por toda la superficie).
•Colocar 4 láminas en sentido vertical de modo Winogradsky se logró identificar los tipos de
tal que queden cubiertas casi en su totalidad y
llenarlo completamente de agua.
bacterias presentes en la raíz del vetiver, que al
•Cubrir y brindar luz artificial durante toda la
duración del proceso (6 semanas).
ser observados en el microscopio presentaron un
color rojizo (gram negativas) se trataba de la
pseudomona, el azospirillum y el azotobacter y
mediante el aislamiento de los nódulos de
AISLAMIENTO DE NÓDULOS Rhyzobium no se llegó a ningún resultado por
DE RHYZOBIUM
falta de tiempo.
• A través de la identificación de las bacterias
endófitas asociadas a la raíz del pasto vetiver
durante el proceso de fitorremediacion se podrá
tratar los suelos contaminados por hidrocarburos
• Escoger una raíz que tenga los nódulos y lavarlo
con agua de la llave para eliminar la mayor cantidad
ACPM (SPIRAX)
de suelo.
• Desprender cuidadosamente el nódulo de la raíz y

Variables / Investigaciones •Ingresar en relación de 1 a 2,5 de suelo y

agua respectivamente.
•Agitar por y reposar.
colocarlo en una caja Petri
• Colocar en dos placas Petri agar nutritivo y en otro
suero fisiológico
• Con ayuda de una pinza flamearla en el mechero
•Insertar el pH ya calibrado
•Se toman 3 mediciones por cada muestra
para obtener mayor exactitud.
para esterilizarla, coger el nódulo y colocarlo en la
placa con agua y dejarlo por 1 minuto.
• Colocar el nódulo en otra caja y machacarlo con un
Trabajos citados
estilete o un hisopo hasta obtener un líquido.
• Raspar o hacer frotis la raíz con ayuda de la
Variables Variable Variable espátula de drigalsky esparcirlo por superficie.
• Invertir las placas e incubar a temperatura ambiente
controladas independiente dependiente de 3 a 4 días. • Alkemi. (22 de 11 de 2017). El cultivo de bacterias en el laboratorio. Obtenido de Alkemi:
https://alkemi.es/blog/como-cultivar-bacterias-en-el-laboratorio/

• Tempertura • Suelo • Bacterias • GIL, L. F. (2013). Aislamiento de bacterias nitrofijadoras endófitas del pasto vetiver (Chrysopogon zizanioides) en
procesos de fitorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos. Obtenido de
• Humedad • Numero de endofitas http://repositorio.ucm.edu.co:8080/jspui/bitstream/handle/10839/1336/Daniela%20C%C3%B3rdoba%20%20Bena
vides.pdf?sequence=1&isAllowed=Y
plantas asociadas al • HERNÁNDEZ VALENCIA, I., NAVAS, G., & INFANTE, C. (2017). FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO
pasto vetiver
• Tipos de
Datos / Observaciones CONTAMINADO CON PETRÓLEO EXTRA PESADO CON Megathyrsus maximus. Obtenido de
http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v33n3/0188-4999-rica-33-03-495.pdf

• INIA. (20 de Mayo de 2015). Obtenido de

bacterias http://inia.uy/Documentos/P%C3%BAblicos/INIA%20Tacuaremb%C3%B3/2015/El%20Suelo%2020%20de%20m
ayo.pdf
endofitas • Microbiología de la columna de Winogradsky. (s.f.). Obtenido de SeminarioBiodiversidad:
• Experimentos en invernadero y en campo http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.htm

• PEREZ, A., & ROJAS, J. (2010). DIVERSIDAD DE BACTERIAS ENDÓFITAS ASOCIADAS A RAÍCES DEL
demostraron que el Vetiver puede crecer bien en PASTO COLOSUANA EN EL DEPARTAMENTO DE SUCRE -COLOMBIA. Acta Biológica Colombiana, 13-14.

suelos con pH entre 3.3 – 9.5 (Danh etal., 2009). • Polo, A. F. (2010). Columna de Winogradsky. Obtenido de PRÁCTICAS DE ECOLOGÍA MICROBIANA :
https://es.scribd.com/doc/59281261/Columna-de-Winogradsky

• signos de fitotoxidad del vetiver 15g/l (Alegre, • Schmidt, D. W. (s.f.). SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS:LA BIORREMEDIACIÓN COMO
UNA SOLUCIÓN ECOLÓGICAMENTE COMPATIBLE. Obtenido de
http://www.ingenieroambiental.com/3021/Bioremed_Mex2.pdf
2007)