PCR DIGITAL

ARANDA BILLOTA WENDY M.

POSTILLOS FLORES MARICIELO S.
PCR EN EL TIEMPO
 PCR DIGITAL
La reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) es un nuevo método que tiene por objetivo la
cuantificación absoluta de los ácidos nucleicos diana (amplicón deseado).

“Avances en microfluidos permitieron la revolución actual de la cuantificación digital, ya que

proporcionan un método de partición eficiente”
 PRINCIPIOS PCR DIGITAL

 La muestra se divide en muchas particiones independientes, de manera que cada una contiene algunas
secuencias objetivo o ninguna.

 La distribución de secuencias de destino en las particiones se puede aproximar con una distribución de
Poisson.

 Cada partición actúa como un microrreactor de PCR individual y las particiones que contienen secuencias
diana amplificadas se detectan mediante fluorescencia.
 Durante la amplificación, las sondas TAQMAN son usadas para detectar secuencias dianas
específicas
 FUNDAMENTOS ESTADÍSTICOS
1) PROBABILIDAD BIOMIAL Y APROXIMACIÓN DE POISSON

Distribución aleatoria de:

M: moléculas
N: particiones

: probabilidad que no esté una molécula

: probabilidad para m moléculas:

=
K: Número de particiones positivas
 La relación de particiones positivas (presencia de
 La fracción de reacciones negativas es usada para generar una
fluorescencia) sobre el número total permite
cantidad absoluta de números de moléculas diana en la muestra,
determinar la concentración del objetivo en la
sin la necesidad de estándares o controles endógenos
muestra
 2) PRECISIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN

Existe un valor de lambda para el cual se puede

estimar la concentración inicial de la plantilla con la
mayor confianza.

• En casos de 10,000 o más particiones, la máxima

confianza se obtiene para un valor de λ de
aproximadamente 1.6. alcanza un nivel óptimo
para λ de 1.6 antes de disminuir lentamente con
valores crecientes de λ, lo que corresponde a una
saturación de las particiones

λ óptimo

“En casos extremos, es decir, cuando la mayoría de las particiones están vacías o llenas, la
confianza en la concentración estimada es muy baja porque el patrón vacío / lleno no es muy
informativo”
3) Número más probable (NMP)
Estas estimaciones se basaron en muestrear repetidamente
un espécimen a diferentes diluciones para optimizar las
posibilidades de estimar la concentración de microorganismos
con la mayor confianza
para estimar la concentración de microorganismos de interés.
4) Sensibilidad de detección
La sensibilidad o el límite inferior de detección
corresponde a la detección de una sola molécula en una
sola partición. Por lo tanto, la concentración mínima que
se puede detectar depende del volumen total de la
reacción o del número de particiones y su volumen.

ENTONCES…

La precisión de la dPCR está limitada por la incertidumbre de la medición debido a:

(1) muestreo de muestras, cuyo efecto es prevalente para concentraciones objetivo bajas y solo se puede
minimizar utilizando réplicas técnicas
(2) (2) su naturaleza estadística cuyo efecto en la precisión puede reducirse aumentando el número de
particiones.
(3) La precisión intrínseca de dPCR no es constante en su rango dinámico y puede ser bastante pobre en los
extremos. Este es el caso cuando la mayoría de las particiones son positivas o negativas.
 Ventajas de la dPCR

• Cuantificación absoluta del

target de interés
• Precisión y
reproducibilidad
• Detección de genes en
mezclas como plasma
• Tolerancia a inhibidores de
la reacción de PCR como
lo son el SDS o la
heparina.
Generación de La muestra es dividida en
los droplets 20 000 droplets
 LECTURA E INTERPRETACIÓN

Droplet
reader

AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS

• Fluorescencia de los droplets

1D- Fluorescent Plot

2D- Fluorescent Plot
Software QuantaSoft
Determinación de la concentración
LEY DE POISSON

COPIAS POR DROPLET = -ln(1-p)

EQUIPOS COMERCIALIZADOS:

QXDx AutoDG
ddPCR System

QX100/200 Bio-rad
 APLICACIONES
Variación del número de copias (CNV) Secuenciación de próxima
generación

Cuantificación precisa de la CNV en pozos

individuales Amplificación y cuantificación precisa de
bibliotecas NGS con validación de resultados
de secuenciación
Análisis de una sola célula
Análisis de la expresión génica
La alta sensibilidad lo convierte en una
herramienta robusta para análisis de una sola
Detección de ARNm raros y miARN con
célula
recambio rápido

Detección de secuencias
Detección de patógenos y análisis de raras en cáncer y enfermedad.
microbiomas

Carga viral y detección de patógenos en trasplantes de Detección de mutaciones y carga viral por
órganos, suelo y alimentos debajo de los niveles detectables por las
pruebas actuales.
 Detección precoz de recaídas después del trasplante alogénico de células madre
hematopoyéticas mediante ensayos de quimerismo: PCR digital versus PCR
cuantitativa en tiempo real de polimorfismos de inserción / deleción

hibridación in situ fluorescente (FISH) de las

células de la sangre y la médula ósea
análisis molecular de polimorfismos VNTR
(número variable de repeticiones en tándem)
STR (repeticiones cortas en tándem) mediante
reacción en cadena de la polimerasa convencional
(PCR)

análisis de fragmentos (gold standard)

INSUFICIENTE sensibilidad y precisión cuantitativa como para ser considerada la estrategia óptima en
la predicción de la recaída morfológica temprana
 En la última década, el uso de la PCR cuantitativa a tiempo
real (qPCR) ha demostrado aportar una mayor sensibilidad,
llegando a detectar hasta un 0,01% de ADN del receptor en
muestras de sangre

“El análisis de los quimerismos hematopoyéticos moleculares (HC) se ha convertido en un método

bien establecido para monitorear la evolución del trasplante y evaluar el riesgo de recaída
después del trasplante alogénico de células madre (alo-STC)”

OBJETIVO DEL ESTUDIO: comparar la sensibilidad y la precisión de ambos

métodos para cuantificar el HC y predecir una recaída temprana
METODOLOGÍA HC: se evaluó utilizando sistemas de PCR personalizados para la detección
específica del cromosoma Y, los alelos nulos y los polimorfismos de inserción-eliminación

Se estudiaron un total de 281 muestras de 28 pacientes adultos que se sometieron a un allo-SCT. Se detectó un
aumento del quimerismo mixto antes de la recaída en el 100% de los pacientes (18 recaídas)
 CONDICIONES
qPCR
Todas las muestras se analizaron por
duplicado y las condiciones de PCR fueron
las mismas para todos los polimorfismos. Las
condiciones del programa del termociclador
consistieron en un paso inicial de
desnaturalización a 95 ° C durante 10
minutos, seguido de 45 ciclos de
amplificación que consisten en
desnaturalización a 95 ° C durante 10
segundos y recocido y extensión a 58 ° C
durante 25 segundos, y un paso final en 40
° C durante 15 s.
dPCR
El análisis de PCR digital se llevó a cabo utilizando el sistema
de PCR digital 3D QuantStudio (ThermoFisher Scientific)
Las condiciones del programa de PCR incluyeron
un paso inicial a 45 ° C durante 60 s, seguido de
un paso inicial de desnaturalización a 98 ° C
durante 150 s, y 40 ciclos de amplificación
consistentes en: 98 ° C durante 60 s, 56 ° C
durante 10 s y 60 ° C durante 30 s.
Los chips se almacenaron en la oscuridad a
temperatura ambiente durante 45 minutos antes
de la lectura con el instrumento QuantStudio 3D
Digital PCR (ThermoFisher Scientific).
El quimerismo del destinatario se calculó
utilizando copias / μL obtenidas del software de
análisis de datos QuantStudio 3D AnalysisSuite
Cloud (v3.1
Receptores quiméricos
RESULTADOS

Comparación de la cinética del quimerismo en cuatro pacientes con recaída de allo-SCT evaluados por dPCR y qPCR. El
análisis de seguimiento por qPCR y dPCR se llevó a cabo utilizando el mismo marcador específico del host. Los datos
representados representan la ventana de tiempo más informativa en el estudio de seguimiento de cada paciente de
trasplante. iMC fue detectado anteriormente por dPCR en pacientes 11, 18, 21 y 25
Receptores quiméricos

Resultados
Indicaron que tanto la qPCR como la dPCR podían predecir la recaída en la sangre periférica antes de que fuera
detectada por microscopía óptica.
En comparación con la amplificación de qPCR convencional, dPCR predijo una recaída con un período de anticipación
promedio de 63 días versus 45,5 días por qPCR. En general, el 56% de las recaídas se predijeron antes con dPCR,
mientras que el 38% de las recaídas se detectaron simultáneamente con ambas técnicas.
 CONCLUSIÓN
 En conclusión,los resultados indicaron que la dPCR a partir de ADN extraído de sangre
periférica constituye un enfoque adecuado para la detección del quimerismo mixto
que permite un pronóstico más rápido de la recaída temprana en comparación con la
qPCR, lo cual podría afectar favorablemente a la salud y la supervivencia de los pacientes
sometidos a trasplantes alogénicos de células hematopoyéticas.
 Metodología

La cuantificación de la fracción
fetal y la cantidad total de
cfDNA se realizó utilizando
ddPCR y condiciones estándar
{volumen de reacción, 20 μL;
150uL
concentración del cebador final 30mL
[sonda], 900 nmol / L [200
nmol / L]; ciclo térmico: [10 ′ 95
° C, 40 × (30 ″ 94 ° C; 1 ′ 60 °
C); 10 ′ 98 ° C], velocidad de
rampa, 2 ° C / s}.
Diagnósticos de trastornos
ligados al X.

si la madre es
portadora se corre
es riesgo de que si
el feto es masculino
se vea afectado
 Mutaciones autosómicas recesivas

Tanto la
madre como
el padre son
portadores
de la misma
mutación.
 DIAGNÓSTICO DE LAS MUTACIONES HETEROCIGOTAS
COMPUESTAS
Deficiencia del receptor de acetilcolina (AChR) de tipo
Fibrosis quística (mutaciones
muscular (mutaciones c459dupA y c753_754delAA)
ΔF508 y W1282X)