PHAGE THERAPY

 
PREPARED BY :
HAGAR RAFAT ABDELGHANY
4th LEVEL OF MICROBIOLOGY , BOTANY DEPARTMENT
 
 
SUPERVISOR :
PROF.DR.ATTIYA HAMED AHMED MOHAMEDIN
Professor of Microbiology , Botany Department , Faculty of Science , Mansoura University .
2018/2019
 
 PHAGE THERAPY :
AN ALTERNATIVE TO ANTIBIOTICS IN THE
AGE OF MULTI-DRUG RESISTANCE
Bacteriophage :
bacterial virus that
infect the bacteria
and reproduced by
their host in
biosynthetic
pathway .

* they are harmless

to human , animals
and plants .
 Abstract :
- The practice of phage therapy, has been around for almost a century. 
the universal decline in the effectiveness of antibiotics and antibiotic-resistance 
becomes a danger and a bigger issue , and the development of new antibiotics is slow ,  
So , attention is turning toward the possibilities of phages to treat antibiotic-resistant 

- Biotechnological advances have expanded the potential of therapeutics ,  include 
novel strategies such as  bioengineered phages and purified phage lytic proteins . 

- used as either an alternative or a supplement to antibiotic treatments.

- both  Antibacterial therapies , whether phages or antibiotics , each have relative 
advantages and disadvantages; so many considerations must be taken into account 
when designing novel therapeutics for preventing and treating bacterial infections .
 Introduction :
phages make up the most abundant biological entity on Earth (With an estimated
10^31 - 10^32 phages in the world) and play an important and critical role in regulating 
bacterial populations; phages are responsible for the death of approximately 
20%-40% of all marine surface bacteria every 24 h .

Almost a decade before the discovery of penicillin ; the practice of phage 
therapy as a treatment for bacterial was developed (e.g. Shigella dysenteriae 
as early as 1919. ) 
Much of the argument and controversy surrounding phage therapy was due to 

* poor documentation of it’s use 
* variable success
* how little was known about phages at the time of their discovery
* the nature of their existence (until they were visualized in the 1940’s after the 
                                       invention of electron microscopy. ) 
* A number of logistical and technical obstacles led  to leave the phage              
therapy after the discovery of antibiotics .
in the mid-20th century , The advent of pharmaceutical antibiotics, with a better 
understanding of disease and sanitation, revolutionized healthcare and improved both 
quality of life and life expectancy in the industrialized world. Antibiotics helped in a new
 era in medicine, rapidly becoming an indispensable medical tool.

Admonitions of a return to “the pre-antibiotic era” have become increasingly common and 
regulatory organizations such as the Centers for Disease Control (CDC) and World Health 
Organization (WHO) have declared antibiotic resistance is a threat to global health.

Since the discovery of antibiotics, there has been a steady stream of novel antibacterial 
pharmaceuticals in what has been called the “antibiotic pipeline”. But due to the rate at 
which bacteria evolve resistance to antibiotics, there has been less commercial interest in 
the research and development of novel compounds of antibiotics .

 
 Antibiotic resistance genes to common antibiotics , including ( β-lactams, aminoglycosides , 
tetracycline and  chloramphenicol ) were a danger and major threat to medical treatment of 
common diseases , and these genes now appear to be abundant and spread in the environment. 

Which reduce effectiveness of antibiotics against common infections , particularly the 
difficult-to-treat nosocomial infections caused by the ESKAPE pathogens (Enterococcus
faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas
aeruginosa, and Enterobacter spp.)

According to the United Kingdom government’s 2016 Review on Antimicrobial Resistance , an 
estimated 700,000 people die each year globally from resistant infections and a death toll of 10 
million by 2050 .

In the United States, methicillin-resistant S. aureus (MRSA) infections alone more deaths than 
HIV/AIDS and tuberculosis combined
In the years of 1983-1987, there were 16 new pharmaceutical antibiotics approved by the 
Food and Drug Administration (FDA) , this number has steadily trended downwards and 
between 2010-2016 only 6 new antibiotics were approved. 

At the end of the antibiotic pipeline is the carbapenem class of antibiotics , often reserved 
as the “last resort” due to their adverse effects on health.

in 2000, the incidence of carbapenem-resistant infections began to increase in the United 
States; due to the lack of treatment options , these infections are associated with a 40%-
50% mortality rate.

On 21  September 2016, the United Nations General Assembly convened to discuss the 
problem of antibiotic resistance and Consider it  “the greatest and most urgent global risk”.

 In the search for alternative strategies for prophylaxis and control of bacterial infection, 
one of the more popular suggestions involves revisiting the practice of phage therapy.
PROPONENTS OF PHAGE THERAPY SEE A SEVERAL MAJOR ADVANTAGES THAT
PHAGES HAVE OVER ANTIBIOTICS SUCH AS
HOST-SPECIFICITY, SELF AMPLIFICATION, BIOFILM DEGRADATION, AND LOW
TOXICITY TO HUMANS. OWING TO THE DEVELOPMENT OF ANALYTICAL TOOLS
CAPABLE OF STUDYING THESE SMALL BIOLOGICAL ENTITIES (APPROXIMATELY
25-200 NM IN LENGTH), SUCH AS ELECTRON MICROSCOPY AND NEXT
GENERATION SEQUENCING ANALYSIS , THESE TECHNOLOGICAL
ADVANCEMENTS WERE A GUIDE IN A RENAISSANCE OF PHAGE THERAPY
RESEARCH WITH A WAVE OF HUMAN CLINICAL TRIALS AND ANIMAL
RESEARCH .
the field of phage biology is only now reaching maturity and
These technological advancements were a guide in a
renaissance of phage therapy research as indicated by a wave of
recent human clinical trials and animal research .
 Phage biology basics :

Phages are simple , yet incredibly diverse, non-
living biological entities consisting of DNA or RNA 
enclosed within a protein capsid , incapable of 
reproducing independently (i.e., non-living) and 
dependent on a bacterial host for survival.

 Phages typically bind to specific receptors on the 
bacterial cell surface, inject their genetic material 
into the host cell, and then either integrate this 
material into the bacterial genome (so called “ 
lysogenic or temperate ” phages) and reproduce 
from mother to daughter cell, or hijack the 
bacterial replication machinery to produce the 
next generation of phage progeny and lyse the cell 
(so-called “lytic or virulent ” phages). 
Conventional phage therapy relies on strictly lytic
phages , which obligately kill their bacterial host.
Host specificity varies among phages, some of which are strain-specific , others infect
a range of bacterial strains and even genera .

The most common lytic phages associated with human pathogens and the gut microbiota 
are in the orders
 Caudovirales , commonly known as “tailed phages” which contain double stranded DNA 
genomes , and 
Microviridae , which are tailless, single-stranded DNA viruses. 
 History of phage therapy

in 1915 Frederick Twort first described the characteristic zone of lysis associated with phage 
infection, but in 1917 Felix d’Herelle who identified the source of this phenomenon , he 
called and refer this plaques to bacterial viruses, and coined the term “bacteriophage” 
(literally “ bacteria eater ”)  
in 1940’s phage therapy was widely dismissed by most of western medicine after the
introduction of pharmaceutical antibiotics . The exception to this is in the former Soviet
Union and Eastern Europe , where clinical phage therapy has been used extensively to
treat antibiotic-resistant infections caused by a range of infectious bacteria such as
Staphylococcus, Pseudomonas, Klebsiella, and E. coli.
 Applications
* collection :

collecting local samples of water likely to contain high quantities of bacteria and 
bacteriophages ( sewage ) .
 
The samples are taken and applied to the bacteria , If the bacteria die , the mixture is 
centrifuged ; the phages collect on the top of the mixture and can be drawn off . 
 The phage solutions are then tested to see which ones show

 
growth inhibition effects (lysogeny)
 
or

 destruction (lysis)

 
The phage showing lysis are then amplified on cultures of the target bacteria, passed 
through a filter , then distributed .
* Treatment :
Phages in practice are applied orally, topically on infected wounds or spread onto
surfaces, or used during surgical procedures. Injection ( intraperitoneal , intravenous
or intranasal ) is rarely used , avoiding any risks may present during bacterial
amplification stage which may result in a trace chemical contaminants, that will
recognizing by the immune system which naturally fights against viruses introduced
into the bloodstream or lymphatic system.
In February 2019, the U.S. Food and Drug Administration approved the first clinical
trial of intravenously administered phage therapy in the United States.

more clinical and microbiological research is needed to meet current standards .

 Administration :

Phages can usually be

freeze-dried and Application in Phage powder
turned into pills liquid form is simpler to handle
without materially possible, stored and easier to
reducing efficiency transport than the
Temperature stability
preferably in
liquid phage
up to 55 °C and shelf refrigerated vials
suspension
lives of 14 months.
Oral administration works better when an antacid is included, as this increases the
number of phages surviving passage through the stomach.

Topical administration often involves application to gauzes that are laid on the area to
be treated.

intravenous phage drip therapy was successfully used to treat a patient with
Multi Drug Resistant Acinetobacter baumannii in San Diego.
 Phage Powders :
simpler to handle and easier to
transport .

Freeze-drying and spray-drying allow

the phage stock to be converted to a
dry powder, which is delivered to a
patient via an inhaler .
 freeze-drying spray-drying

A recent study outlines a

method for lyophilizing is another method of
and encapsulating phage producing pharmaceutical
in biodegradable poly(DL- powders , allowing for a
lactic-co-glycolic acid) greater selection in particle
microspheres.Which characteristics and it cause
delivered directly to the less damaging to the phages
lungs via a dry powder than lyophilization ( freeze-
inhaler . drying ) .

This method shows great

promise for long-term long-term viability of the
phage storage. spray-dried phages was not
determined .
 Obstacles :
1- The high bacterial strain specificity of phage therapy may make it necessary for clinics 
to make different cocktails for treatment of the same infection or disease because the 
bacterial components of such diseases may differ from region to region or even person 
to person , so  'banks' which containing different phages must be regularly updated with 
new phages . 

2- The need for a regulatory testing for safety harder and more expensive under current 
rules in most countries ,so it will be difficult in the large-scale use of phage therapy. 

 3-  bacteria can evolve and alter different receptors either before or during treatment ; 
this can prevent phages from completely destroying bacteria .
4- No lytic phage has yet been discovered for Clostridium difficile, which is responsible for 
many nosocomial diseases , but some lysogenic phages are known for this species ; this 
opens encouraging ways but with additional risks . 

 because Funding for phage therapy research and clinical trials is generally insufficient and 
difficult to obtain , since it is a lengthy and complex process to patent bacteriophage 
products. 

5- Due to the specificity of phages, phage therapy would be most effective with a cocktail 
injection , which is generally rejected by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).

6- The negative public conception of viruses .
PHAGE AGAINST CLINICALLY
SIGNIFICANT PATHOGENS :
* in animal models (hamster model); by oral and Intraperitoneal administration 

- EX(1): when treat Clostridium difficile (C. difficile)-induced ileocecitis ; a single dose of phage with Clostridium difficile administration saved 11 of 12 mice ; where control animals receiving C.

difficile and clindamycin (antibiotic) died within 96 h .
- Ex(2): Intraperitoneal administration in bacteremia models was sufficient to rescue 100% of Mice from molarity .
- Ex(3): when treat antibiotic-resistant P. aeruginosa infections of the skin, lungs, and gastrointestinal tract by using phage cocktails.
- EX(4): When treat gut-derived sepsis due to P. aeruginosa , saved 66.7% of mice from mortality .

  
* In human trials ;there is an Effective applications  (therapeutic and prophylactic) ; range 
from surgical to gastroenterological applications .

- Ex(1): in treat antibiotic unresponsive diabetic foot ulcers in a 6 patient, a topical 
application of S. aureus-specific phage was sufficient for recovery in all individuals .

-Ex(2): in 1938 clinical trial , 219 patients with bacterial dysentery were treated with a 
phage cocktail consisting of a variety of phage targeting a various number of bacteria , 
cocktails were administered both orally and rectally . 
Within 24 h, 28% of patients with blood in their stools were relieved of this symptom, with 
a further 27% showing improvement within 2-3 d. Overall, 74% of the 219 patients showed 
improvement or were completely relieved of symptoms.
 
-Ex(3): in 1974 a group of 18577 children with typhoid epidemic, using typhoid phages. 
Phage administration resulted in a 5-fold decrease in typhoid incidence compared to 
placebo . 
currently in the European Union or United States there are no phage therapy 
products approved for human use , but in food industry, there are several 
commercial phage preparations used for biocontrol of bacterial pathogens 
that are approved by the FDA (Food and Drug Administration)  under the 
classification of “generally considered as safe.” These preparations are used 
against  Salmonella spp., Listeria monocytogenes, MRSA, E. coli O157:H7,
Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter spp., and Pseudomonas syringae, 
among others . 
 
-Ex(4):  it can be an effective method for improving food safety at
 numerous stages in meat production and processing , reduce bacterial 
contamination in fruits, vegetables, and in dairy products . 

 
-Ex(5): gene editing tool CRISPR/Cas have created novel chances  for phage 
therapy. One example is the use of bioengineered phage to deliver a 
CRISPR/Cas programmed to disrupt antibiotic resistance genes and destroy 
antibiotic resistance plasmids.
 A summary of human phage therapy trials
and the range of target sites/infections
 DEVELOPMENT AND APPLICATION OF
PHAGE-DERIVED LYTIC PROTEINS :
 
the most promising of advances in phage therapy is the isolation of phage-encoded lytic enzymes , which are functionally similar to the antimicrobial eukaryotic enzyme lysozyme.

*  It opens the possibility for the development of novel
 phage-based pharmaceuticals .

* These Genes are expressed in the bacterial host during the lytic cycle and assist the phage to release viral progeny by hydrolyzing the cell wall.
Two major protein classes :  
1- The transmembrane protein ( holin ) 
2- peptidoglycan cell wall hydrolases protein endolysin (lysin)

 
 * both are work together to lysis the bacterial cell
 * considered as antimicrobial agent 
 * some are highly specific but others can exhibit broad-spectrum       
     activity between strains and even between species . 
 * fast acting , potent , and inactive against eukaryotic cells. 

  
 The transmembrane peptidoglycan cell wall
protein hydrolases protein
( holin ) endolysin (lysin)

accumulate  in the cell membrane  Access to cell membrane from the 
during phage assembly and trigger a  opening and hydrolyze the cell wall 
huge pores on the cytoplasmic side 
of the cell membrane allowing the 
lysin proteins to access 

incapable of lysis bacterial cell  capable of lysis bacterial cell 
alone alone  

Infect Gram-negative bacteria Infect Gram-positive  bacteria

broad killing spectrum by 
cleaving peptidoglycan linkage of 
bacterial membrane 
- Pinholins accumulate in the periplasm as inactive 
can be mass produced through  membrane-tethered enzymes. 
common recombinant techniques - pinholin breakdown the proton motive force 
Ex :  recently discovered (PMF), allowing the endolysin to fold to an active 
 lysin ABgp46 .  form and hydrolyze bonds in the peptidoglycan 
cell wall.
- a spanin complex disrupt the outer membrane by 
fusion of the inner and outer membranes 
PHAGE THERAPY VS ANTIBIOTIC THERAPY :

Both antibiotics and phages function as 
antibacterial , but there are several differences 
make each antibacterial more or less appropriate 
depending on the situation. 
 1- Safety :
Antibiotics Phage
- oral phage administration is generally safe . 
- majority of adverse reactions  - The  phage is translocated across the 
are allergic reactions ; include  intestinal epithelium then circulate within 
the blood . 
anaphylaxis, nephrotoxicity,  - phage tran slocation may benefit the host by 
cardiotoxicity, hepatotoxicity,  - down regulating the immune response to 
and neurotoxicity.  indigenous gut microbe antigens through 
the inhibition of interleukin-2, tumor 
- associated with specific  necrosis factor, and interferon gamma 
production. 
classes of antibiotics or with the  -  some studies discovered a host innate 
product of high tissue con cen  immune response aimed at removing phage 
trations . after administration in mice .
 2 – specificity
Antibiotics Phage
- possibility of large scale  - limits the possibility of largescale production and distribution 
due to high host specificity 
production and distribution . - phages tend to be specific towards both species and strain.
- collateral effects of broad  -  The current collateral damage is limited , but compared to 
spectrum antibiotics on antibiotics ; 
- less perturbation of the gut microbiome and reducing gut 
gut microbes , such as  carriage of pathogens such as Shigella sonnei and uropathogenic 
antibiotic-associated  E. coli.
- Constraints : phage therapy could be less effective against 
diarrhea and C. difficile  infections such as infected burn wounds, which are often 
infection. colonized by more than one strain of bacteria . This can be 
overcome by creating phage cocktails infective against a range 
- risk of asthma , obesity,  of known pathogens  . 
and diabetes. 
 3 – biofilm penetration
Antibiotics Phage
high doses of antibiotics are required  Phages, are equipped with enzymes
to observe  (e.g., EPS depolymerase) on the exterior 
of the capsid that degrade the extracellular 
- any inhibition of bacterial growth polymeric substances (EPS) and disperse 
- and complete eradication is rare  bacterial biofilms, allowing the phage to 
- and regrowth of colonies begins  access bacteria embedded within the EPS 
after the end of antibiotic  matrix .
treatments .
high concentrations can result in  Phage treatment can not only degraded 
tissue toxicity . existing biofilms , but also prevented 
additional formation of biofilm by the 
pathogen .
                                                                  Conclusion

 The available studies on the use of phages and phage derived proteins for combating 
bacterial infections, specifically those of multidrug-resistant bacteria, increasingly 
shows promise for the probability of phage therapy as either an alternative or a 
supplement to antibiotics . But we still need a better understanding of the interaction 
between phage, microbiome, and human host before implementing phage therapy on a 
large scale.
But despite the promising findings on phage and phage-derived lytic proteins, it is likely 
that no panacea (a solution for all difficulties or diseases )  for antibiotic-resistant infections will 
arise.
 
Although much is still unknown about the interactions between phage, bacteria, and
human host, the time to take phage therapy seriously seems to be rapidly approaching.