DETERMINATION OF LEVULINIC ACID IN SOY

SAUCE BY LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH MASS

SPECTRONIC DETECTION

Anggota kelompok:
1. Harsiwi Candra Sari (160332605805)
2. Indi Ngazifatul Muna (160332605892)
3. Janis Kafidzul Luthfi (160332605849)
4. Jannatul Firdaus (160332605835)
5. Mega Ariyanti (160332605856)
6. M Tri Sandhya Utama (160332605870)
LATAR BELAKANG
Kecap secara tradisional diperoleh secara enzimatik dari
campuran kedelai dan gandum panggang selama berbulan-bulan. Proses
produksi ini dapat dipercepat menggunakan hidrolisis asam dari kacang
kedelai (yang telah dihilangkan lemaknya) atau gluten gandum. Beberapa
kecap diproduksi sebagai campuran dari kecap yang dibuat secara
tradisional dengan acid-HVP (acid-Hydrolyzed Vegetable Protein).
Namun selama produksi acid HVP, dihasilkan senyawa
karsinogenik tertentu seperti 3-kloro-1,2-propanadiol atau 1,3-
dikloropropanol.
LATAR BELAKANG
Oleh karena itu senyawa tersebut merupakan pembeda yang
akurat antara 100% kecap yang diproduksi secara alami (NBS), asam-HVP,
dan campuran NBS dan asam-HVP.

Uji Kualitatif menggunakan kadar LV (Levulinic Acid) sebagai

indikator pembeda dari NBS (Naturally Brewed Soy Sauce) dengan asam-
HVP. LV pada acid-HVP berasal dari aktivitas asam pada karbohidrat di
kedelai. NBS tidak mengandung LV dan tidak memiliki zat aditif. Oleh
karena itu, LV adalah indeks yang tepat untuk penentuan kadar asam-
HVP dalam kecap campuran (Blanded Soy Sauce).
LATAR BELAKANG

Analisis instrumental kuantitatif untuk menentukan LV dalam

kecap adalah metode penganalisa asam karboksilat, HPLC, dan GC.
Kadar LV secara spesifik di NBS tidak terdeteksi dengan metode
penganalisa asam karboksilat, HPLC, maupun GC. Oleh karena itu,
kandungan LV dianggap cocok sebagai indeks untuk pembeda antara
NBS dengan acid-HVP.
LATAR BELAKANG

Di samping itu, terdapat hasil yang berbeda yang diperoleh peneliti

lain yang menunjukkan bahwa terdapat LV pada NBS dengan rentang 2-
19.4 mg/mL menggunakan GC.
Kerugian dari GC mencakup hasil bahwa beberapa senyawa
coeluate dengan komponen yang dimaksud setelah banyaknya dilakukan
injeksi dan analisis, sehingga mungkin tidak teridentifikasi dengan benar
hanya menggunakan waktu retensi. Oleh karena itu perlu untuk
mengembangkan metode analitik baru untuk LV dengan akurasi dan
presisi yang lebih tinggi.
LATAR BELAKANG
Peneliti melakukan pengembangan metode kuantitatif yang sangat
tepat dan sensitif untuk menentukan LV dalam kecap dengan kromatografi
cair ditambah dengan spektrometri massa (LC-MS). Peneliti juga
menyelidiki kegunaan dari dua metode yang dilaporkan dalam HPLC dan
GC , serta membandingkan LC-MS untuk memverifikasi akurasi penentuan
LV dalam kecap.
Selain NBS dan acid-HVP, kecap gluten gandum yang telah
dihidrolisis secara enzimatik juga diukur untuk kadar LV. Hal ini
memungkinkan estimasi jumlah asam-HVP yang dicampur dengan NBS
dalam kecap yang tersedia secara komersial. Selain itu, jumlah LV yang
ditentukan mengidentifikasi sampel uji, apakah itu NBS, asam-HVP, atau
asam-HVP campuran dengan NBS.
2. BAHAN DAN METODE
Sampel Kecap

o NBS (22 sampel) dibel dari tujuh produsen kecap di Jepang, tiga di
Taiwan, dan satu di Inggris
o Asam-HVP atau kecap campuran (14 sampel) berasal dari empat
produsen di Jepang, tiga di Taiwan, dan sat di Amerika Serikat.
o Kecap yang dihidrolisis secara enzimatik (6 sampel) disediakan oleh
dua pabrik di Jepang dan Singapura
Reagen

o LV dibeli dari Industri Kimia Tokyo Co, Ltd (Tokyo, Jepang).

o Asetonitril dan air suling untuk LC – MS berasal dari Kanto
Chemical Co.Inc.(Tokyo, Jepang)
o Asam format untuk HPLC dari Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
(Osaka, Jepang).
o Air suling ganda untuk pengenceran sampel dimurnikan
menggunakan sistem Milli-Q (Millipore, Bedford, MA).
LC-MS
 Data dikumpulkan oleh Perangkat lunak MassLynx ver.4.0 di komputer
pribadi.
 Kolom HPLC yang digunakan adalah kolom Atlantis dC18, 5 µm, 2.1 mm x
150 mm
 Di atur ke 28oC selama semua prosedur yang berjalan, dan volume
injeksi adalah 5 µl
 Dua fase gerak digunakan untuk menghasilkan gradien linier dengan laju
alir 0,2 mL / menit.
 Fase gerak A adalah air dengan 0,01% (v / v) asam format , dan fase
gerak B adalah asetonitril dengan asam format 0,01% (v / v)
LC-MS
 Linier gradien adalah dari 0% hingga 10% B selama 12 menit pertama dan
dari 10% hingga 50% B selama 3 menit berikutnya;
 Fase gerak B disimpan pada 50% selama 3 menit dan dikurangi menjadi 0%
untuk 1 mnt
 Akhirnya kolom diseimbangkan dalam 0% B untuk 21 mnt.
 Untuk 5 menit pertama dan dari 12 menit berikutnya eluen diarahkan ke
limbah untuk menghindari kontaminasi dari spektrometer massa dengan
garam atau komponen pencucian.
LC-MS
 LV terdeteksi dengan electrospray ionization probe (ESI) dalam mode negatif.
Suhu sumber adalah 150oC, aliran untuk melarutkan dan gas tegangan kerucut
masing-masing adalah 600 L / jam dan 50 L / jam, tegangan kapiler diatur ke 3,2
kV, dan tegangan kerucut disesuaikan ke 18 V.
 Pemantauan ion selektif (SIM) diperoleh oleh sebelumnya infusi standar dalam
mode pemindaian penuh pada konsentrasi 0,05 mg / mL. Pengenceran sampel
kecap dua kali lipat biasanya diterapkan untuk analisis LC-MS setelah membran
filtrasi menggunakan filter selulosa asetat dengan Ukuran pori 0,45 µm. Ketika
LV yang terdeteksi melebihi 0,1 mg / mL, yang adalah batas atas kurva standar
LV, pengenceran lebih lanjut sampel diperlukan, yaitu pengenceran ekstra 20
kali lipat.
GC

Masing-masing sampel kecap

diencerkan 10 kali dengan air suling
untuk pengukuran GC.

Agilent 5890 GC yang

dilengkapi dengan detektor
ionisasi nyala (FID) .
HPLC Pada 430 Nm
• Penentuan LV dalam kecap ditentukan
menggunakan metode post-column dari Peralatan HPLC
Yen-Chen and Hsu dengan sedikit
modifikasi.
• Kolom tukar kation LC adalah 10-20 l m Pompa CCPM-II (Tosoh Co, Tokyo,
jenis sulfonat berpori kopolimer stirena- Jepang), UV8020 detektor UV variabel
divinil-benzena (Shodex Rspak KC-811, 8,0 (Tosoh Co, Tokyo, Jepang), seorang
mm id 300 mm) dan kolom pra adalah 20- AS8020 autosampler (Tosoh Co, Tokyo,
30 l m, dengan bahan yang sama (Shodex Jepang), dan AO50 kolom oven (Showa
Rspak KC-LG, 8,0 mm id 15 mm) Denko KK, Tokyo, Jepang). Data
• Fasa gerak yang digunakan 3,5 mM HClO4 dikumpulkan oleh Tosoh multi-stasiun
software LC-8020 di komputer pribadi .
• Laju alir 0,8 mL/menit
• Temperatur kolom dipertahankan pada
50oC
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tes pemulihan
Pemulihan LV yang ditambahkan ke NBS diukur dengan tiga
metode. Pemulihan dilusi dua kali lipat diperoleh dengan metode LC-MS
dan HPLC pada panjang gelombang 430 nm, tetapi gangguan jarang
ditemukan ketika metode GC digunakan. Untuk mengurangi tumpang tindih
puncak dengan HPLC pada 430 nm, lebih dari lima kali pengenceran
dengan air suling ditentukan menjadi praktis. Dalam prosedur GC, injeksi
berturut-turut tanpa pengenceran sampel dilaporkan oleh Wang et al.
menyebabkan deposisi bahan pada inlet sampel untuk menurunkan
ketepatan analisis. Karena itu perlu untuk melakukan pengenceran 10 kali
lipat dengan air suling dan injeksi kosong pada setiap injeksi sampel.
Batas Deteksi Dengan LC–MS

Untuk larutan standar, pengenceran dibuat dalam destilasi air

dengan asam format 0,05% (v / v) diberikan konsentrasi sebagai berikut:
0,100, 0,050, 0,020, 0,010, 0,005, 0,002, dan 0,001 mg / mL. Kurva standar
dibuat dengan memplotkan bidang puncak analit larutan standar versus
konsentrasi teoritis. Presisi dan ketepatan metode LC-MS dinilai dalam
seluruh rentang konsentrasi.
Batas deteksi adalah 0,01 mg / mL dalam saus kedelai yang tidak
diencerkan sebagaimana didefinisikan oleh konsentrasi sampel terendah
yang bisa diukur dengan presisi yang baik (standar deviasi relatif <20%).
Penentuan LV Di NBS
Tabel 1
Hasil kadar LV dalam 100% kecap alami dari tiga metode berbeda
Yaitu : LC-MS, GC, dan HPLC pada 430 nm
 Hasil kromatogram
penentuan kandungan
LV pada NBS dan
acid-HVP
Penentuan LV Dalam Asam-hvp Dan Estimasi Asam-hvp Di BS
 LV adalah terdeteksi secara signifikan di semua 14 sampel asam-HVP.
(Tabel 2)
Penentuan LV Dalam Asam-hvp Dan Estimasi Asam-hvp Di BS

 Untuk memperkirakan konsentrasi asam-HVP di BS, disiapkan kecap

campuran buatan antara NBS dan acid-HVP dalam lima rasio campuran
berbeda. (100: 0, 75:25, 50:50, 25:75, 0: 100, v / v), dan menentukan
konsentrasi LV
 LV yang terdeteksi di BS linear terhadap tingkat aditif asam-HVP
dengan NBS ( R 2 = 0,9990)
Fig. 2. (a) HPLC chromatogram at 430 nm of acid-HVP (Sample no. 13 in Table 2), (b) LC–MS chromatogram in
selective LV ion monitoring mode of the isolated peak as LV in acid-HVP (Sample no. 13 in Table 2), (c) HPLC
chromatogram at 430 nm of enzymatic HVP (Sample no. 4 in Table 3), (d) LC– MS chromatogram in selective LV ion
monitoring mode of the isolated peak as LV in enzymatic HVP (Sample no. 4 in Table 3).
Penentuan LV Dalam HVP Enzimatik

o Tabel ini menunjukkan kandungan LV dalam sampel HVP enzimatik yang

ditentukan oleh metode LC-MS, GC, dan HPLC pada panjang gelombang 430
nm.
o Hasil pengukuran dengan metode LC-MS dan GC berada di bawah batas deteksi
LV (0.01 mg/mL) pada hvp enzimatik, sedangkan dengan HPLC diperoleh pada
rentang 0.17 – 3.29 mg/mL LV
 Produksi LV lebih kecil kemungkinannya selama proses produksi HVP
enzimatik karena tidak menggunakan proses hidrolisis asam dengan keasaman
dan panas yang kuat.
LV terdeteksi oleh HPLC di panjang gelombang 430 nm mungkin
merupakan gangguan yang terjadi bersamaan dengan waktu retensi LV. Untuk
mengklarifikasi ketidakpastian dari puncak LV yang terdeteksi oleh HPLC pada
430 nm, puncaknya diisolasi dengan kromatografi cair preparatif dan
dianalisis oleh LC-MS dalam mode SIM LV (Gbr. 2).
Puncaknya dalam asam-HVP (Sampel no. 13 dalam Tabel 2)
diidentifikasi sebagai LV berdasarkan waktu retensi dan massa molekul
oleh LC- MS (Gbr. 2a dan b). Namun, puncak dalam HVP enzimatik
(Sampel no. 4 pada Tabel 3) dinyatakan tidak memiliki m/z 115, yang
merupakan ion negatif dari LV oleh LC-MS (Gbr. 2c dan d)
Hasil ini menunjukkan bahwa puncak terdeteksi sebagai LV oleh HPLC
pada 430 nm dalam HVP enzimatik bukan LV tetapi senyawa lain dengan
waktu retensi yang sama.
Kerugian HPLC pada 430 nm senyawa yang coeluate bersama dengan LV
selama proses HPLC dan mungkin tidak teridentifikasi dengan benar ketika
menggunakan detektor yang tidak spesifik seperti Detektor UV-VIS.
Keunggulan LC-MS termasuk identifikasi puncak dengan analisis dua tahap
dari waktu retensi dan spektrum massa. Fitur analitik ini menunjukkan bahwa
metode LC-MS lebih akurat dan tepat daripada HPLC pada 430 nm untuk
penentuan LV yang terkandung dalam kecap. Penelitian ini mengungkapkan
bahwa LV berada di bawah batas deteksi dalam HVP enzimatik.
 KESIMPULAN
o Metode LC-MS dikembangkan untuk menentukan LV pada NBS, acid-HVP,
HVP enzimatik dan BS dengan akurasi dan presisi baik.
o Analisis ini menunjukkan bahwa tidak ada LV dalam NBS atau HVP enzimatik
dan terdeteksi dengan jelas bahwa terdapat LV dalam asam-HVP dan campuran
kecap kedelai dengan asam-HVP.
o Hasil ini menunjukkan bahwa LV adalah indeks / parameter praktis dari
pencampuran dengan asam-HVP dan juga sesuai dengan kriteria JAS dan / atau
CNS dimana keberadaan LV dalam kecap menunjukkan adanya pemalsuan
dengan asam-HVP.
 KESIMPULAN

o Sementara itu, hanya HPLC pada 430 nm yang memberikan deteksi LV HVP
enzimatik, namun telah dikonfirmasi bahwa puncak yang dihasilkan
bukanlah LV dengan identifikasi spektrometri massa dari puncak senyawa
yang terisolasi.
o Perlu untuk berhati-hati dalam penentuan LV melalui HPLC dengan UV-
VIS-detector atau metode GC hanya berdasarkan waktu retensi dalam bahan
yang kompleks seperti kecap.
o Metode LC-MS optimal secara analitik untuk ketepatan penentuan LV.