HPLC (High-performance

liquid chromatography)
Introducción a HPLC

•Inicialmente se refería a:

High Pressure Liquid Chromatography

•En la actualidad hace referencia a:

High Performance Liquid

Chromatography
En general…

• En una cromatografía participan:

1. Fase estacionaria
2. Fase móvil
3. Muestra
¿Cómo interaccionan?
En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la
mezcla de moléculas que se desea separar (muestra)
interaccione con un medio o matriz de soporte que se
denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil)
que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través
de ésta para "lavar" (eluir) a las moléculas en la muestra.
HPLC
• La cromatografía de líquidos de alta
resolución, es un modo de cromatografía
en la cual el proceso de separación y
transferencia de masa es entre la fase
estacionaria y la fase móvil y una
temperatura dada.
HPLC
• Es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas
entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.
HPLC
• La HPLC, representa una de las herramientas más empleadas
en el laboratorio analítico moderno.
• La cromatografía es un método, usado primariamente para la
separación de los componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.
• Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su análisis.
• Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta técnica.
HPLC
• En la HPLC, el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de
la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas
redondeadas con ciertas características químicas en su superficie).
• Esto lo hace mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a
través de la columna.
• La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna.
• El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de
la fase móvil.
• El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa
característica de un compuesto en una determinada fase móvil y
estacionaria.
 Disolventes HPLC
• Los disolventes más utilizados son:
- Agua
- Metanol
- Acetonitrilo
• El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético,
que ayudan a la separación de los
compuestos.
Características HPLC
• Selectividad
• Reproducibilidad
• Sensibilidad
• Rapidez
Parámetros HPLC
• Naturaleza de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula
• Eluyente (composición y flujo)
• Detector
• Tamaño de poro
• Presión de la bomba
TIPOS DE HPLC
• Fase Directa: separa compuestos en base a su
polaridad.
- Fase estacionaria polar
- Fase móvil de baja polaridad
- El compuesto de interés a analizar es muy polar
• Fase Reversa:
- Fase estacionaria de polaridad baja
- Fase móvil de polaridad alta
- El compuesto de interés a analizar es apolar
TIPOS DE HPLC
• Exclusión molecular ò filtración en gel
- Separa las partículas de la muestra en función de su tamaño.
- Útil para la determinación de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.
• Intercambio iónico
- La retención se basa en la atracción electrostática entre los
iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria.
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de
carga opuesta son retenidos por la columna.
Tipos de HPLC
• Bioafinidad
- Se basa en la capacidad de las sustancias
biológicamente activas de formar complejos
estables, específicos y reversibles.
- La formación de estos complejos implica la
participación de fuerzas moleculares entre las
partículas de la muestra y la fase estacionaria.
 Mecanismos de interacción en HPLC

• Adsorción superficial
• Partición
• Intercambio iónico
• Exclusión molecular
Adsorción superficial
• La fase estacionaria es sólida. La separación se
logra por las diferencias en solubilidad (en
fase móvil) y de retención por adsorción (en
fase estacionaria) de la mezcla de solutos.
Adsorción superficial
• Fases estacionarias más comunes: sílica y alúmina.
• Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son
atraídas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria.
• Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase
estacionaria y así se logrará su migración diferencial.
• Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder
de elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo
(acetona, cloruro de metilo, etc).
Partición
• La separación se basa en el reparto o distribución de los
solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un sólido inerte.
• La discriminación se produce por diferencias de solubilidad.
• Las especies más retenidas serán las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase
móvil (eluyente).
Partición

• Existen dos modos básicos de operación:

- Fase normal. Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase móvil no polar.
- Fase reversa. Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase móvil polar.
 Fase móvil
• Si es un gas: Modalidad cromatográfica
gaseosa.
• Si es un líquido: Cromatografía líquida.

• Cromatografía en capa delgada.

• Cromatografía líquida en columna abierta
HPLC.
• Alta pureza (calidad HPLC).
• Inactividad frente a la fase estacionaria.
• Baja viscosidad.
• Compatibles con la muestra.
• Facilitar la recuperación de la muestra.
• Compatibilidad con el sistema de detección.
• Según su composición varíe o no con el tiempo:
• Elución isocrática
• Elución en gradiente
• Los disolventes deben desgasificarse antes de uso
empleo en HPLC.
• La desgasificación reduce el riesgo de formación
de burbujas en la columna o en el detector.
• Posibilidades:
• Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
• Aplicación de vacío
• Sonicación
• Calentamiento
 Cromatografía de partición
• Existen dos modos básicos de operación:
• Fase normal. Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase móvil no polar.
• Fase reversa. Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase móvil polar.
• Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero
en la actualidad son más comunes los métodos
cromatográficos en fase reversa dada la
naturaleza hidrofílica delas muestras de mayor
interés (clínico, contaminación, alimentos).
• Según empleemos fase directa o fase reversa
se nos va a alterar el orden de elución de
bandas y el tiempo de análisis.
• Materiales comerciales empleados como
soportes en cromatografía de adsorción y
partición.
Principales fases moviles en HPLC
 Cromatografía de intercambio iónico
• Tanto fase estacionaria como fase móvil son
de naturaleza iónica.
• La iones de la fase estacionaria son de carga
opuesta a los del eluyente.
• Se emplean rellenos en los cuales la partícula
está constituida por un polímero o por sílica
gel
• Se emplea para el análisis de todo tipo de iones
(inorgánicos y orgánicos).
• Las moléculas intercambiadoras se ligan a
soportes específicos.
• El material intercambiador de la fase estacionaria
es de diámetro de partícula pequeño (1-10 μm) y
estructura microporosa o pelicular con capacidad
de cambio muy baja respecto al material
intercambiador convencional (10-2 – 10-3
meq/g).
Cromatografía de exclusión molecular
• Emplea materiales de porosidad controlada,
que funcionan como un filtro o tamiz y
clasifica las moléculas de la muestra según un
orden decreciente de tamaño molecular. Si se
dispone de estándares apropiados, de peso
molecular adecuado, puede evaluarse el PM
de un compuesto desconocido
• Como fase estacionaria se emplea un material
poroso inerte (gel) que permite la discriminación
entre los solutos según su tamaño.
• 􀂃 Los analitos de mayor tamaño no pueden
penetrar en los poros de la fase estacionaria y
son excluidos, viajando con la fase móvil en el
frente de la misma.
• Se muestra especialmente útil para determinar el
rango molecular de polímeros, proteínas, etc.
 Equipos
• Integrados: Cada una de sus partes están
reunidas en un gabinete y su intercambio o
conexión con otros componentes es difícil.
• Modulares: Los módulos son instrumentos
individuales que permiten no solo armar el
equipo según las necesidades, sino aumentar
su complejidad según esa necesidad varíe.
• Están formados por:
• Solvente
• Bomba de alta presión
• Inyector
• Columna
• Detector
• Graficador
 Solventes
• Alto poder solubilizante de las muestras.
• Baja reactividad.
• Adecuado punto de ebullición.
• Baja viscosidad.
• Seguridad.
• Alto grado de Pureza.
• Propiedades químicas: estas propiedades de la
fase móvil, son las que establecen el tipo y
fuerza de interacción entre el solvente y la
muestra, en consecuencia, son determinantes
de la separación.
• Índice de polaridad: Resultante de todas las
propiedades químicas e intenta medir
cuantitativamente la fuerza de interacción de
los solventes frente a solutos polares.
• Fuerzas dispersivas: Indican la polarizabilidad de
una molécula y aumentan con el número de
electrones de la misma y con la distancia de éstos
al núcleo.
• Capacidad aceptora o donadora de protones:
Medida de la capacidad de las moléculas de
intercambiar protones.
• Momento dipolar: Se refiere a la capacidad de
una molécula para formar dipolos permanentes y
está estrechamente relacionado con la constante.
dieléctrica del solvente.
• Las fases móviles están constituídas por mezclas de
solventes polares, en general agua, y un modificador
orgánico, con o sin el agregado de aditivos.
• Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con
solventes no polares, y pueden considerarse tanto
solventes de fase normal como de fase reversa.
• El agua destilada y desionizada, puede encontrar varias
limitaciones en HPLC. La razón de esto reside en la
presencia de sustancias orgánicas que no se eliminan
con el tratamiento aplicado
• Solventes comunes
• Metanol HPLC.
• Acetonitrilo HPLC.
• Tetrahidrofurano HPLC.
• Dioxano HPLC.
• Sales de sodio y potasio
BOMBAS
• Presión estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14,696 psi
• Flujo libre de pulsaciones
• Amplio rango de flujos (0,1 a 10
mL/min)
• Control, exactitud y
reproducibilidad del flujo
• Componentes químicamente
inertes y resistentes a la corrosión
 SISTEMAS DE INYECCIÓN
• Se emplean válvulas inyectoras de volumen
(loop) constante.
• Pueden ser manuales o automáticas.
• Para variar el volumen de inyección se debe
cambiar el “loop” correspondiente.
• Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyección.
 SISTEMAS DE INYECCIÓN
• Se emplean válvulas inyectoras de volumen
(loop) constante.
• Pueden ser manuales o automáticas.
• Para variar el volumen de inyección se debe
cambiar el “loop” correspondiente.
• Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyección.
 COLUMNAS
• Gran avance en la última
década por el progreso en la
tecnología de rellenos y
columnas.
• Rellenos más uniformes y de
menor tamaño.
• Fases químicamente ligadas a
los soportes aumentando su
eficacia y resolución.
• Mejora en los métodos de
empaquetado.
• Las columnas constan de:
-Cuerpo – Normalmente de acero
inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3
mm o 4.6 a 5 mm.
-Relleno – El material de relleno de una
columna está constituido por partículas,
definidas por una serie de características.
(morfología, tamaño, porosidad, estructura
química)
• Al disminuir el tamaño del relleno aumenta la
eficiencia pero también la presión de trabajo
 Fase
Fase Reversa
Normal
• Sílica
•• C-2 o
AlúminaRP-2 (-SiCH2CH3)
• C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)
•• Amino (-NH2)
C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
• Nitrilos (-CN)
• Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Influencia de la longitud de la
columna y del tamaño de
partícula en la duración del
cromatograma
 DETECTORES

• Se pueden clasificar
Cualquier propiedaden:física o química que se
Detectores
pueda medir enque
la miden una podría
disolución propiedad de
usarse
la fase
como móvil.de
método (Detector de Indice de
detección.
Refracción)
• Los detectores en HPLC no son destructivos
Detectores que miden una propiedad de
los solutos. (Detector de Fluorescencia,
Detector Ultravioleta )
 Principales detectores empleados en
HPLC
• UV/Vis
• Fotodiodos
• Índice de refracción
• Fluorescencia
• Conductividad
• Dispersión de luz
• Espectrometría de masas
• Detector UV.
– Detector de Longitud de Onda Fija
– Detector de Longitud de Onda Variable
– Detector de Arreglo de Diodos
• Detector de Índice de Refracción.
– Tipo Deflexión
– Tipo Fresnel
• Detector de Fluorescencia.
– Este detector solamente puede detectar compuestos
que tengan fluorescencia nativa o inducida por
derivatización.
• Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
– Según la Fuente de Excitación
– Según el sistema óptico
 DETECTOR UV/VIS
• Para sustancias que absorben radiación
UV/VIS
• El más usado
• Con lámparas de deuterio, xenon o wolframio
• Desde 190 a 900 nm

Camino óptico de la microcelda de

un detector UV/VIS.
Las celdas ordinarias tienen 0,5
cm de camino óptico y contienen
8 μL de líquido
 DETECTOR FOTODIODOS
• Permite registrar la absorbancia simultánea en
todo el rango UV/VIS.
• La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las
diversas λ que la componen y las hace incidir a
la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una
λ diferente, que manda la información al
sistema de análisis de datos.
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
• Van a medir variaciones en el índice de refracción
del eluato con respecto al del disolvente puro.

• Sólo se pueden usar si la elución es isocrática.

•Responden casi todos los solutos pero con escasa

baja sensibilidad.

• Son muy sensibles a las variaciones de

temperatura.
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE
ÍNDICE DE REFRACCIÓN
•El disolvente pasa a través de la mitad de
una cubeta y el efluente de la columna pasa
por la otra mitad.

•Los dos compartimentos están separados

por una placa de vidrio montada a un ángulo
tal que si las dos disoluciones difieren en
índice de refracción se produce una
desviación del haz incidente.
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
• Paraanalitos fluorescentes por naturaleza o
derivados fluorescentes.

•Son de alta sensibilidad.

•No se ven interferidos por los disolventes al no

tener éstos naturaleza fluorescente.
 DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
• Son detectores basados en una respuesta
diferencial y no absoluta.

•Empleados fundamentalmente en cromatografía

de intercambio iónico.

Inconvenientes:

• Baja sensibilidad

•Sensibles a impurezas de la fase móvil.

DIAGRAMA DEL DETECTOR DE
CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del
sensor, la impedancia eléctrica entre los
electrodos cambia "fuera de la señal de
equilibrio“. Desde el puente se alimenta a un
circuito electrónico adecuado.
 DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ

•Válido para aquellos solutos que sean claramente menos

volátiles que la fase móvil.

•El eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando

una nube de finas partículas sólidas que entran en la zona de
detección.

Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo

láser
y llega al fotodetector por dispersión.

•Sólo tampones volátiles en la fase móvil.

 DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ

Se utiliza un spray que continuamente atomiza el

eluyente de la columna en pequeñas gotas. Estas
gotas se deja evaporar, dejando los solutos como las
partículas finas suspendidas en el gas de
atomización.
APLICACIONES DEL METODO HPLC

Cuantificación de aminoácidos
en plasma.
Cromatograma
 ¿ QUE ES UN CROMATOGRAMA?

Es un grafico de la señal de concentración de

un analíto en función del tiempo.
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION.

Es la relación entre la concentración molar del

soluto en la fase estacionaria y se concentración
molar en la fase móvil.
Kc=Cs/Cm

En donde Cs es la concentración molar de

soluto en la fase móvil y Cm es la
concentración del mismo en la fase
estacionaria
 TIEMPO DE RETECION

El tiempo requerido para que el analíto sea detectado después de ser inyectado
se conoce como tiempo de retención y se representa mediante el símbolo Tr. El
analíto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria. Tm es una
especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migración
de la fas móvil y es importante para identificar picos
Tr= Ts + Tm

señal

tiempo
 FACTOR DE RETENCION

Es un parámetro experimental importante que

se usa mucho para comprobar las velocidades
de migración de solutos en columnas.
Ka= Ts/Tm

FACTOR DE SELCTIVIDAD

El factor de selectividad de una columna

proporciona una medida de la eficacia
con que la columna puede separarlos.
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION