CITOQUÍMICA

UNIDAD 1.2
Carbohidratos – Biología Molecular

FACILITADOR DOCENTE
Licenciado David A. Uranga Leo
UNIDAD 1.2 CARBOHIDRATOS – BIOLOGÍA MOLECULAR.
ESTUDIO CITOQUIMICO DE LOS HIDRATO DE CARBONO

Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas)que están compuestos por
carbono, oxigeno e hidrogeno.

Los polisacáridos son glúcidos de moléculas muy voluminosas formadas por la condensación de muchas moléculas de monosacáridos
(mas de diez) con la correspondiente perdida de la moléculas de agua y constituyen el grupo de hidratos de carbono.

Entre ellos destacan los mas importantes

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES:
Polisacáridos complejos

Se subdividen en tres grupos mas complejos • Grupos funcionales

Carbono carbonílico (C=O)
Hidroxilo (-OH)
• Mucopolisacaridos
• La posición del carbonílico determina
• Mucoproteinas formación de:
• Mucolipidos Aldosas (polihidroxialdehídos)
Cetosas (polihidroxicetonas)

• Carbohidratos derivados pueden

contener N, P, S.
ESTUDIO CITOQUIMICO DE LOS HIDRATO DE CARBONO
MUCOPOLISACARIDOS
Pueden dividirse en dos grupos

MUCOPOLISACARIDOS Neutros (MPN)

Constituidos por un azúcar (generalmente galactosa) y acetilglucosamina que con frecuencia se atan
unidos a una proteína formando glucoproteína o mucoproteinas. Esta sustancias son PAS positivas.

MUCOPOLISACARIDOS Ácidos (MPA)

Por hidrolisis originan siempre, además de monosacáridos, hexosaminas (glúcidos aminados) a veces
acido uronico (monosacárido con un grupo carboxílico en posición 6, acido glucuuronico, acido
galacturonico). Y casi siempre acido sulfúrico o fosfórico, el mucopolisacaridos acido mas simple es el
acido hialuronico.

Se subdivide en:
Formula Química del Ácido Hialurónico
• MPA sencillos
• Carboximucopolisacaridos o
mucopolisacaridos no sulfatados
• MPA complejos o sulfatados
(sulfomcopolisacaridos)
ESTUDIO CITOQUIMICO DE LOS HIDRATO DE CARBONO

MUCOPROTEINAS

Son complejos de proteínas y polisacáridos en los que predomina el primer

componente, son similares a las glucoproteína, pero se diferencian en su mayor
contenido de hexosaminas.

Este tipo de sustancias suelen asociarse y pueden ser halladas en células betas
de la hipófisis, membranas basales reticulina y fibras colágenas. Todas ellas son
PAS positivas y no experimentan metacromasia frente al azul de toluidina.

MUCOLIPIDOS

Son una mezcla de polisacáridos y ácidos grasos complejos que s encuentran

normalmente en forma de cerebrosidos y gangliosidos. Suelen ser PAS positivos y
se tiñen selectivamente con ciertas coloraciones para grasa.
 CARBOHIDRATOS MAS IMPORTANTES
GRUPOS NOMBRE COMPONENTE FUNCIÓN
1. Ribosa y Desoxirribosa. 1. Pentos 5 carbonos. 1. Integrar nucleótidos: ATP, DNA,RNA.
2. Glucosa. 2. Hexosa 6 carbonos. 2. Energía / reservas.
Monosacáridos 3. Fructuosa. 3. Hexosa 6 carbonos. 3. Es convertida en glucosa.
4. Galactosa. 4. Hexosa 6 carbonos. 4. Es convertida en glucosa.

1. Sacarosa. 1. Glucosa + Fructosa. 1. Energía.

Disacáridos 2. Maltosa. 2. Glucosa + Glucosa. 2. Energía.
3. Lactosa. 3. Galactosa + Glucosa. 3. Energía.
1. Almidón. 1. α – D – Glucosa. 1. Reserva de energía vegetal.
Polisacáridos 2. Glucógeno. 2. α – D – Glucosa. 2. Reserva de energía animal.
3. Celulosa. 3. Β – D – Glucosa. 3. Fibra dietética no digerible.

• DETERMINACIÓN CITOQUÍMICA DE CARBOHIDRATOS

Reacción basada en la demostración de grupos carbonilos preformados por oxidación previa

● Reacción de PAS
● Técnica de la Plata Metenamina
REACCIONES CITOQUIMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILOS

REACTIVO DE SCHIFF (REACCIÓN DE PAS)

• Es de amplia aplicación en el diagnostico citopatologico rutinario

• Puede colorear numeroso componente bioquímicos

• Siendo una reacción poco especifica puede convertirse en enormemente

selectiva mediante los correspondientes controles.

FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN DE PAS

Consiste en oxidar a los tejidos mediante el acido periódico para incrementar el

numero de grupos carbonilo(aldehidos o cetonas) presente en ellos de forma que
puedan ser demostrados posteriormente mediante el reactivo de schiff.
REACCIONES CITOQUIMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILOS

REACTIVO DE SCHIFE

Se obtiene a partir de la fucsina básica la cual es tratada con acido sulfuroso que hace
desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula transformándose en una
sustancia incolora (acido sulfofucsinico o reactivo de schiff).
Cuando el reactivo de schiff se une con dos grupos aldehídos contiguos aparece de nuevo el
doble enlace (grupo cromógeno) y con el la coloración rojo fucsina característica.

Formula Química del Reactivo de Schiff

COMPUESTOS PAS (+)
• Polisacáridos simples: glucógeno, celulosa
• Mucopolisacaridos neutros
• Mucoproteinas
• Glicoproteínas
• Glucolipidos
• Determinados pigmentos
PROTOCOLO TÉCNICO DE PREPARACIÓN DE LA COLORACION DE ACIDO PERYODICO DE SCHIFF ( P.A.S)
 COLORACION DE PAS - REACTIVO DE SCHIFF PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE PREPARACIÓN
DE REACTIVO SCHIFF DE COLEMAN
PROTOCOLO DE COLORACION DE PAS
Desparafinar e hidratar. a) Solución «stock»
Acido periódico al 0.5%, durante 5 minutos.
Lavado en agua destilada. Fucsina básica 1,0 gr
Reactivo de Schiff, 15 a 30 minutos.
Agua destilada
Aclara en tres baños de sulfuroso, 2 minutos en cada uno. 200 mL
Disolver suavemente / calentar a 60
Lavar en agua corriente durante unos minutos.
Hematoxilina de Harris, 30 a 60 segundos. b) Solución de Trabajo
Lavar en agua corriente durante unos minutos.
Deshidratar, aclarar y montar. 1.- Llevarlo a punto de ebullición
PROCEDIMIENTO:
Si se desea tratar la muestra con una coloración de contraste para lograr un 2.- Dejarlo enfriar y luego agregar
resultado débilmente positivo, se puede utilizar un contraste citoplasmático Metabisulfito de Potasio ……………………….. 2.0g
como amarillo de Mars o bien el simple contraste nuclear por hematoxilina Acido Clorhídrico 1N……………………………..10.0g
de Harris.
Si se espera un resultado fuertemente positivo, se podrá colorear con azul de 3.- Dejarlo aclarar durante 24 horas y luego agregar
toluidina, verde de metileno o picrocarmín de índigo. Carbón Activado ………………………………. 0,5g
NOTA TECNICA:
Los compuestos PAS positivos:
Polisacáridos simples: glucógeno, celulosa, entre otros, Mucopolisacaridos Luego que se tiene la solución preparada se debe agitar durante
neutros, Mucoproteínas que incluyen, ciertas mucinas del tubo digestivo y del 1 minuto, luego se debe filtrar a través de papel de filtro grueso.
árbol bronquial, tiroglobulinas, entre otros, Glucoproteínas del suero, Repetir la filtración hasta que la solución aparezca totalmente
membrana basal y fibras de reticulina, Glucolípidos como gangliosidos y incolora , se recomienda trasvasar la solución a un recipiente
cerebrosidos. Determinados pigmentos como pigmetos ceroide, entre otros. transparente y mantenerlo en un ambiente totalmente refrigerado
RESULTADOS:
Núcleos: Azul y material PAS positivos: Rojo oscuro a magenta
PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE PREPARACIÓN DE LA
PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE SOLUCION HEMATOXILINA DE MEYER
ÁCIDO PERYODICO AL 5% Hematoxilina 1g

Acido peryódico 0,5 g Agua destilada: disolver y añadir: 1000 mL

Agua destilada 1000 Ml Yodato sódico: disolver mediante un agitador

0,2 g
magnético (no calentar):
PROCEDIMIENTO TECNICO DE SOLUCION DE ÁCIDO CLORHIDRICO 1N
Alumbre potásico o amónico 50 g
Acido clorhídrico 83,5ml
Ácido cítrico 1g
Agua Destilada 916,5ml Hidrato de cloral 50 g
REACCIONES CITOQUIMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILOS

COMPUESTOS PAS (-)

• Mucopolisacaridos ácidos: tienen bloqueados los enlaces 1 y 2 glicol por grupos COOH y no
pueden ser oxidados por el acido periódico.

COLORACIONES DE CONTRASTE

• Si se espera un resultado débilmente positivo de la técnica se utilizara un contraste

citoplasmático con amarillo de Mars o bien el simple contraste de la hematoxilina de
Harris.
• Si se espera un resultado fuertemente positivo podrá colorease con azul de toluidina,
picroarmin de índigo o verde de metilo.
CONTROLES DE LA TECNICA DE PAS

TÉCNICAS DE BLOQUEO PARA GRUPOS ALDEHÍDOS EN GENERAL

Se realiza tratando los grupos aldehídos presentes en el tejido tras la oxidación

con acido periódico con una solución de 5 por 100 de acido acético saturado con
dimentona entre 1 y 16 horas a 60° C.

TÉCNICAS DE BLOQUEO MEDIANTE ACETILACIÓN PARA GRUPOS 1,2 GLICOL

Se fundamenta en la negatividad de la reacción de PAS, este tratamiento es total o

parcialmente reversible por saponificación ulterior mediante tratamiento con
hidróxido potásico.

Acetilar: introducir un grupo acetilo en un compuesto orgánico

Saponificar: romper un enlace de tipo éster de forma que en condiciones idóneas
reaparezca el grupo químico que existía antes de la acetilación.
TECNICA DE LA PLATA METANAMINA

Radica en la reducción que sobe las sales complejas realzan lo radicales carbonilos formados por oxidación
previa de los hidratos de carbono, de forma que la plata metálica obtenida precipita sobe las estructuras que se
va n a teñir.

Por todo ello la técnica debe realizarse con un control continuo de PH de modo
que l precipitado de la plata metálica no ocurra anticipadamente.

TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACARIDOS ÁCIDOS

Los mucopolisacaridos ácidos(MPSA) son una variante de polisacáridos que no contienen

grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol si no grupos ácidos carboxílicos o sulfatados, este echo
los diferencia de los mucopolisacaridos neutros (MPSN) con grupos hidroxilos en posición 1,2
glicol y que por consiguiente son PAS (+).

SON PRINCIPALMENTE TRES:

• Técnica del hidrato de hierro coloidal de hale

• Técnica de azul de alcian

• Reacción metacromatica
TÉCNICA DE LA PLATA METENAMINA

• El fundamento de esta técnica es la oxidación de los Hidratos de Carbono mediante el ácido crómico y el ácido
peryódico. Estos Hidratos de Carbono oxidados reducen las sales de Plata que contiene el reactivo, haciendo
precipitar la plata metálica sobre la estructura a teñir.

• El complejo salino es de metenamina argéntica, el cual es muy inestable y se mantiene como sal a pH alcalino 8.3 y
9.2; fuera de éste se disocia en sus dos componentes.

• La técnica debe realizarse con un control continuo de pH, de modo que la precipitación de la plata metálica no ocurra
anticipadamente.

• Por sus características especiales, esta técnica se emplea para visualizar membranas basales sobre todo en el riñón
(glomerulonefritis), compuestas en gran medida por hidratos de carbono del tipo glicoproteínas.
PROTOCOLO TÉCNICO DE PREPARACIÓN DE LA COLORACION DE
GROCOTT

PROTOCOLO TÉCNICO DE COLORACION DE

GROCOTT PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE PREPARACIÓN
DEL MÉTODO DE GROCOTT
• Agua destilada
• Utilizar ácido crómico al 5 % durante 1 hora Solución «stock»

• Lavar con Agua corriente Ácido Crómico 5%

• Utilizar bisulfito sódico al 1% durante 1 min Bisulfito Sódico 1%
• Lavar con Agua corriente 5 min
Nitrato de plata mentanamina
• Lavar con Agua destilada 4 cuatro veces
Solución de almacenamiento:
• Utilizar la solución de Metan amina al 60°C
durante 1 hora Nitrato de plata al 5 % 5 mL
• Lavar con Agua destilada 6 seis veces
Metanamina al 3 % 100 mL
• Cloruro de Oro al 0,1 %
Solución de Trabajo :
• Lavar con Agua destilada
• Solución tiosulfato durante 5 min Solucion de almacenamiento 25 mL

• Utilizar Verde Luz durante 30 segundos Agua Destilada 25 mL

(contraste)
Borato Sódico al 5 % 2 mL
• Lavar con Agua destilada
Verde Luz 10.0mL
• Deshidratar, aclara y montar
 TÉCNICA DE HIDRATO DE
LA PLATA METANAMINA DE GROCOTT:
HIERRO COLOIDAL DE HALE:

Es un método de tinción especial más

empleado para hongos. La reacción
tintorial está basada en que, en presencia
de ácido peryódico, los polisacáridos de
la pared celular de los hongos son
oxidados a aldehídos; éstos, a su vez,
reducen el complejo nitrato-plata
metanamina (o metenamina) produciendo
una coloración de café a negra, debido al
depósito de plata reducida en los lugares
de localización de los aldehídos.
Fundamento
En la atracción electroestática de las
carga positivas del hidrato de hierro
coloidal y las cargas negativas de los
Mucopolisacáridos ácidos y luego, en
la determinación del hierro férrico por
medio de la técnica del Azul de Perls.

DETERMINACIÓN DE
MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS:
LA TÉCNICA DE GOMORI Los mucopolisacaridos ácidos son unos
MODIFICADO: polisacáridos que no tienen grupos
alcohólicos en posición 1,2 glicol sino
Es una variante de la plata grupos ácidos carboxilos o sulfatados.
metenamina.
• Técnica de hidrato de hierro coloidal
Lo que correspondería a PAS+ se de Hale
teñirá de negro: glucógeno, mucina,
• Técnica de Azul de Alcián
hongos, membranas basales,
reticulina y elastina. • Reacción metacromática.