Diana Laura jerónimo López 1885697

introducción
Fundamento
Metodología
a) Mezcla se trata con b) separar mediante electroforesis c) El gel se retira del aparato y se aplica a
SDS (detergente en un gel de SDS-poliacrilamida una hoja de nitrocelulosa o nylon (une
desnaturalizador (SDS-PAGE) (discrimina los proteínas) y las proteínas y el gel se
componentes según su peso transfieren a la hoja mediante el paso de
potente)
molecular) una corriente eléctrica.
d) La adición de anticuerpos
e) Añadir sustrato para activar
unidos a enzima detecta el la reacción de color
antígeno de interés
a) se trata con SDS (detergente desnaturalizador potente)
b) luego se separa mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE) (discrimina los componentes según su peso molecular)
c) El gel se retira del aparato y se aplica a una hoja de nitrocelulosa o nylon (une proteínas)
y las proteínas y el gel se transfieren a la hoja mediante el paso de una corriente eléctrica.
d) La adición de anticuerpos unidos a enzima detecta el antígeno de interés
e) la posición de los anticuerpos se observa mediante una reacción ELISA que genera un
producto insoluble de color intenso el cual se deposita en el sitio de la reacción.
f) De otra manera puede utilizarse un ELISA quimioluminiscente para generar luz que se
detecta con facilidad al exponer una pieza de película fotográfica a la blot (mancha).
Resultados
Aplicación de la técnica
Ventajas y desentajas
Bibliografía
 Es posible la identificación de una proteína específica en una mezcla compleja de proteínas mediante una técnica
conocida
 como Western blotting,

 En la Western blotting, una mezcla de proteínas se separa por medios electroforéticos en un gel de SDS-
poliacrilamida (SDS-PAGE), un gel en placa con infusión de dodecilsulfato sódico (SDS), un agente de disociación
 Las bandas de proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis, y las bandas
 individuales de proteína se identifican al inundar la membrana
 de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas específcas para la
proteína de interés.
 Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene
 la proteína reconocida por el anticuerpo pueden visualizarse de
 diversos modos.

 Si un anticuerpo radiactivo se unió a la proteína

 de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot)
 exponiendo una placa de rayos X a la membrana, un procedimiento
 que se conoce como autorradiografía.
 Sin embargo, en los
 procedimientos de detección que más se usan suelen emplearse
 anticuerpos unidos a enzima contra la proteína.

 Tras la unión del

 conjugado de enzima y anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno
 que produce un producto de color intenso e insoluble
 origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno
 blanco.
 Puede lograrse una sensibilidad mucho más alta si se usa
 un compuesto quimioluminiscente aunado a agentes de realce
 adecuados para producir luz en el sitio del antígeno.
LA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING TAMBIÉN PUEDE IDENTIFI
CAR UN
ANTICUERPO ESPECÍFI CO EN UNA MEZCLA. EN

 En este caso los antígenos

 conocidos de peso molecular bien defi nido se separan mediante
 SDS-PAGE y transfi eren a nitrocelulosa.

 Las bandas separadas

 de antígenos conocidos se prueban luego con la muestra que
 se sospecha contiene anticuerpo específi co para uno o más de
 estos antígenos.
 La reacción de un anticuerpo con una banda
 se detecta mediante el empleo de anticuerpo secundario radiomarcado
 o ligado a enzima específi co para la especie de los anticuerpos
 en la muestra en estudio.
 La aplicación más amplia de este procedimiento es como prueba de confirmación de VIH, donde la Western
blotting se utiliza para determinar si el paciente tiene anticuerpos que reaccionan con una o más proteínas víricas.
 El término "transferencia" se refiere a la transferencia de muestras biológicas de un gel a una membrana y su
posterior detección en la superficie de la membrana. Towbin, et al., Introdujeron un experimento de transferencia
Western, o transferencia Western (también llamada inmunotransferencia, porque se usa un anticuerpo para
detectar específicamente su antígeno). en 1979 y ahora es una técnica de rutina para el análisis de proteínas. La
especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno permite identificar una proteína diana en medio de una mezcla
compleja de proteínas. La transferencia Western puede producir datos cualitativos y semicuantitativos sobre la
proteína de interés.
INTRO

 El primer paso en un procedimiento de transferencia Western es separar las macromoléculas en una muestra
usando electroforesis en gel. Posteriormente, las moléculas separadas se transfieren o se transfieren a una
segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF). A
continuación, la membrana se bloquea para evitar cualquier unión inespecífica de anticuerpos a la superficie de la
membrana. Con mayor frecuencia, la proteína transferida se sondea con una combinación de anticuerpos: un
anticuerpo específico para la proteína de interés (anticuerpo primario) y otro anticuerpo específico para la
especie huésped del anticuerpo primario (anticuerpo secundario).
 A menudo, el anticuerpo secundario está complejado con una enzima, que cuando se combina con un sustrato
apropiado, producirá una señal detectable. Los sustratos cromogénicos producen un precipitado en la membrana
que produce cambios colorimétricos visibles para el ojo. Los métodos de detección más sensibles utilizan un
sustrato quimioluminiscente que produce luz como un subproducto de la reacción con la enzima conjugada con
el anticuerpo. La salida de luz se puede capturar con película.
 Sin embargo, los instrumentos de imágenes digitales basados en cámaras con dispositivo de carga acoplada (CCD)
se están convirtiendo en alternativas populares a la película para capturar señales quimioluminiscentes.
Alternativamente, se pueden usar anticuerpos marcados con fluorescencia, que requieren detección usando un
instrumento capaz de capturar la señal fluorescente. La transferencia fluorescente es una técnica más nueva y está
creciendo en popularidad, ya que ofrece el potencial de multiplexar (detectar múltiples proteínas en una sola
transferencia). Cualquiera que sea el sistema utilizado, la intensidad de la señal debe correlacionarse con la
abundancia del antígeno en la membrana.
 Los procedimientos varían ampliamente para el paso de detección de un experimento de transferencia Western.
Una variación común implica la detección directa versus la detección indirecta. Con el método de detección
directa, se usa un anticuerpo primario conjugado con enzima o fluoróforo para detectar el antígeno de interés en
la transferencia. Este método de detección no se usa ampliamente, ya que la mayoría de los investigadores
prefieren el método de detección indirecta por varias razones. En el método de detección indirecta, un
anticuerpo primario no marcado se usa primero para unirse al antígeno. Posteriormente, el anticuerpo primario
se detecta usando un anticuerpo secundario conjugado con enzima o fluoróforo. Las etiquetas (o moléculas
conjugadas) pueden incluir biotina, sondas fluorescentes como Invitrogen Alexa Flour o DyLight flourophores, y
conjugados enzimáticos como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP). El método
indirecto ofrece muchas ventajas sobre el método directo, que se describen a continuación.
MÉTODO DIRECTO

 Ventajas
 Requiere solo un anticuerpo
 Elimina problemas con la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios
 Desventajas
 La etiqueta puede interferir con el enlace del objetivo
 Potencial de alto fondo si la especificidad de anticuerpos para el objetivo es débil
 Los anticuerpos primarios conjugados pueden ser costosos
 La selección de anticuerpos primarios conjugados puede estar limitada
INDIRECTO

 Ventajas
 Amplificación de señal por anticuerpo secundario
 Amplia selección de anticuerpos secundarios conjugados.
 Se puede usar un anticuerpo secundario con varios anticuerpos primarios diferentes
 El uso de anticuerpos secundarios no inhibe la unión a la diana del anticuerpo primario
 El uso de anticuerpos secundarios marcados proporciona opciones para múltiples métodos de detección.
 Desventajas
 La tinción inespecífica puede aumentar el fondo
 Se requieren pasos adicionales cuando se usa un método indirecto
SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS.

 La electroforesis en gel es una técnica en la cual las moléculas cargadas, como proteínas o ADN, se separan de
acuerdo con las propiedades físicas, ya que son forzadas a través de un gel por una corriente eléctrica. Las
proteínas se separan comúnmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para caracterizar
proteínas individuales en una muestra compleja o para examinar múltiples proteínas dentro de una sola muestra.
Cuando se combina con la transferencia Western, PAGE es una poderosa herramienta analítica que proporciona
información sobre la masa, carga, pureza o presencia de una proteína.
 Existen varias formas de PAGE y pueden ofrecer diferentes tipos de información sobre las proteínas de interés.
Por ejemplo, la PAGE no desnaturalizante, o PAGE nativa, separa las proteínas de acuerdo con sus relaciones de
carga de masa. En contraste, el dodecilsulfato de sodio-PAGE, o SDS-PAGE, separa las proteínas de acuerdo con la
masa debido a la carga negativa que se imparte a las proteínas unidas al detergente iónico SDS.

 Varios sistemas de amortiguación o químicas de gel están disponibles para la electroforesis en gel de proteínas.
Cada sistema proporciona ventajas únicas al resolver proteínas de diferentes pesos moleculares.