Por Criollo Sánchez Daniela

6FM2
¿Qué es?
• Es una técnica de separación de mezclas que contienen analitos o
sustancias semivolátiles ,no volátiles o que se descomponen con
calentamiento.
Fase estacionaria

Tiempo de retención corto

Tiempo de retención
Mezcla
grande
Fase móvil
Tiempo de retención total (tr1 o tr2)
• Es el tiempo necesario para que el componente de una muestra migre
desde la entrada de la columna (inyección de la muestra) al final de la
columna(detector).
Tiempo muerto (t0)
Tiempo requerido por un compuesto inerte para que migre de la entrada
de la columna al final de la columna sin ninguna interacción por la fase
estacionaria.
Tiempo de retención neto o corregido (t´R1 o t´R2 )
• Es la diferencia entre el tiempo de retención total y el tiempo muerto t0 . Que
es el tiempo que permanece el analito en la fase estacionaria.
t´R1 = tR1 – t0 t´R2 = tR2 - t0
Factor de capacidad (k)

• Es una medida de la velocidad de migración de los solutos en la

columna .
Retención relativa (α)

• Es una medida de separación entre dos picos

Velocidad lineal del disolvente

• Es la velocidad lineal promedio (u cm/seg ) del movimiento de las

moléculas de la fase móvil.
Número de platos teóricos (N)
• Proporciona una medida de eficiencia de la columna
Altura de plato teórico (H)
• Longitud de columna en que se lleva a cabo una separación.

L
H
N
Clasificación de HPLC
• HPLC fase normal Polaridad

Polaridad

• HPLC fase reversa

Polaridad
Compuestos orgánicos no
volátiles.
Polaridad
 Fase reversa

C8H17 (C-8 o n-octil)

Siloxano

• Fase móvil Polaridad.

C18H37 carbonos (C-18 o n-

• octildecil)
Acetonitrilo

• PH 7.5
 Componentes

Disolventes
Disolvente Polaridad Disolvente polaridad

•
Pentano
Heptano
0.0
Disolventes.
0.1
Metil terbutil éter
o-Xileno
2.5
2.5
Disolventes
Hexano 0.1 Benceno 2.7
Eter petróleo 0.1 Clorobenceno 2.7
Isooctano 0.1 o-Diclorobenceno 2.7

Ciclohexano 0.2 Eter etílico 2.8

Hexadecano 0.5 Cloruro de metileno 3.1
Tricloroetileno 1.0 Dicloro etileno 3.5
Tetracloruro de carbono 1.6 Isopropanol 3.9
Tolueno 2.4 2- butanol 4.0
Disolvente Polaridad Disolvente Polaridad

Alcohol isobutílico 4.0 Metanol 5.1

Tetrahidrofurano 4.0 Piridina 5.3
Cloroformo 4.1 Carbonato de 5.5
dietilo
Metil isobutil cetona 4.2 2- Metoxi etanol 5.5
Acetato de etilo 4.4 Acetonitrilo 5.8
Metil n-propil cetona 4.5 Propilen carbonato 6.1
Metil etil cetona 4.7 Dimetil formamida 6.4
2- Etoxietanol 5.0 Dimetil acetamida 6.5
Fenetilamina 5.0 Dimetil sulfóxido 7.2
Acetona 5.1 Agua 10.2
Filtros
• Filtración
• Desgasificación
Bombas
Reciprocas
Inyectores
• Válvulas de inyector
• Loop
Precolumnas
• Aumentan la vida de la columna.
• Elimina materia en suspensión y contaminantes de los disolventes.
• Satura la fase móvil con la fase estacionario (minimiza perdidas) .
• Relleno semejante al de la columna.
• Tamaño de partícula mayor (Minimizar la caída de presión).
Columnas
• Hechas de acero inoxidable
• Sin de 10-30cm de longitud, con diámetro de 4-10mm. (25cm l, 4.6mm de diámetro y 5
micras)
• El amaño del empaque es de 5-10 micras.
• A temperatura ambiente. Relleno
• Sílice
• 3-10 micras de
diámetro.
Detectores
• Basados en propiedad de la fase móvil
I. Índice de refracción
II. Constante dieléctrica
III. Densidad
• Por el soluto
I. Absorbancia
II. Fluoresecencia.
III. Intensidad de sifusión.
Absorbancia UV
Fase móvil
• Los disolventes deben ser de alta pureza (Evitan adsorciones
irreversibles y picos fantasmas)
• Filtrarse (en membrana de 0.5micras)
• Utilizar precolumna.
 Elección de la columna

1)

• Moléculas (PM menor a 2000) • PM mayores a 2000)por ej.

2) Poro y partícula pueden distribuirse fácilmente proteínas y péptidos,
en poros de 80-120Å requieren un tamaño de
poro mayor 300 Å

3) Longitud de la
columna

4)Diámetro de la
columna
Cuidados de de la columna
• Estables a un ph de 2-8

• Evitar golpes o shoks en estas que provoquen divisiones de picos. (

(hasta 6000 psi con sílica)
• Eluyentes con alta pureza
Problemas más comunes en una HPLC
• Presión alta
• Forma de pico indeseable
• Cambios en la retención/selectividad