JULHO - 2015

01

RESUMO

 Esclerose Múltipla (EM)

 Curcumina
 Forma polimerizada da nano-curcumina (PNC)
 Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE)
 Ratos Lewis fêmea
 Administração de Curcumina via intraperitoneal
 02

INTRODUÇÃO

 ESCLEROSE MÚLTIPLA
 Definição
 Etiologia
 Susceptibilidade de desenvolvimento da doença
 Processos neurodegenerativos
 Estresse oxidativo, excitotoxicidade
 03

INTRODUÇÃO

Fonte: www.lookfordiagnosis.com
Fonte: Caicó, 2014

Estresse oxidativo Excitotoxicidade

 04

INTRODUÇÃO
 CÚRCUMA (Cúrcuma longa)
 Especiaria
 Medicina Ayurvérdica (Índia)
 Tratamento de doenças
 Hidrófobo polifenol (componente ativo) Fonte: www.martikaskitchen.com

 Agente Terapêutico Potencial em Doenças Neuro-inflamatórias

 Efeitos Anti-inflamatórios e Antioxidantes com humanos
 Biodiponibilidade no corpo (insolubilidade nos fluidos
corporais, rápida eliminação do corpo) adjuvantes,
 05

INTRODUÇÃO
 ENCEFALOMIELITE AUTO-IMUNE EXPERIMENTAL (EAE)
 É um modelo animal experimental para doenças desmielinizantes do Sistema
Nervoso Central
 “Padrão ouro" de modelos animais com disfunções neuroimunológicas
 Cúrcuma e a EAE (anti-inflamatório e anti-oxidante)
 Desmielinização X Reparação da mielina
Obs: EAE foi induzida acidentalmente em humanos durante a
vacinação contra a raiva, usando vírus cultivados em medula
espinhal de coelhos. Resíduos de injeção espinhal com o vírus
 06

INTRODUÇÃO

 DENDROSSOMA para melhorar a solubilidade da nanopartícula

de curcumina

 OBS: “encapsulamento de dendrímeros pelos lipossomas”

 Material biodegradável

 Neutro

 Anfipático
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MATERIAIS E MÉTODOS

 ANIMAIS

 Ratos Lewis fêmeas adultas

 Peso: 150 e 200g

 4 por gaiola (12h de luz / 12h escuro)

Fonte: http://www.jove.com/video/51275/mielina-
 Temperatura controlada oligodendrocyte-glicoprotena-mog?
&language=Portuguese
 08

MATERIAIS E MÉTODOS
 INDUÇÃO - ENCEFALOMIELITE AUTO-IMUNE EXPERIMENTAL (EAE)

 6 a 9 animais alocados aleatoriamente para cada grupo

experimental 1mL
1mg
Medula Água GPSCH GPSCH => Cobaia Homogeneizado Medula Espinhal
espinh destila
al da

Adjuvan
te Emulsão
complet de
GPSCH o de imunizaç
Freund ão
(CFA)
Cada mililitro de CFA continha 500 mg de
Mycobacterium tuberculosis inativado por calor
 09

MATERIAIS E MÉTODOS

 DIA 0

 Injecções subcutâneas de 0,4 ml de emulsão de imunização na

base da cauda

Emulsão de
imunização

Fonte:
http://www.jove.com/video/51275/mielin
a-oligodendrocyte-glicoprotena-mog?
 10

MATERIAIS E MÉTODOS

 No dia da imunização e 48 horas mais tarde

 Foram injetados por via intraperitoneal (IP)

250 mg de toxina da tosse convulsa + 0,2 ml de água
destilada

Fonte:
http://www.jove.com/video/51275/miel
ina-oligodendrocyte-glicoprotena-
mog?&language=Portuguese
 11

MATERIAIS E MÉTODOS
 Os animais foram diariamente pesados ​e monitorização dos sinais

clínicos de EAE ESCOR SINAL CLÍNICO

E

00 Sem sintomas

01 Paralisia da cauda completa

02 Paresia leve de membros posteriores

03 Paralisia completa de um membro posterior

04 Paralisia bilateral dos membros posteriores

Fonte: 05 clínicos
Paralisia completaem(tetraplegia), estado
http://audioslides.elsevier.com
Escores foram observados média a partir do dia 10 da IP
 12

MATERIAIS E MÉTODOS

Forma Polimerizada de Nano-Curcumina (PNC)

 ANIMAIS DO GRUPO TRATAMENTO

 12,5 mg/kg de curcumina, uma vez por dia a partir do dia 12 até o dia 29
 ANIMAIS
IP DO GRUPO PRÉ-TRATAMENTO

 Animais recebeu mesma dose de PNC, do dia 0 até o dia 29

Forma Não Polimerizada de Curcumina
 ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE

 Ratos tratados diariamente com 12,5 mg / kg IP - curcumina

dissolvido em PBS (Tampão Fosfato-Salino do inglês Phosphate
 13

MATERIAIS E MÉTODOS
 FORAM UTILIZADOS OS SEGUINTES GRUPOS EXPERIMENTAIS:

GRUPO TRATAMENTO

01 Pontuações clínicas foram

Ingênuos / Ratos não tratados avaliadas diariamente e
02 analisados para comparar a
Imunizados / Ratos tratados com PBS gravidade da doença entre os
03 grupos de animais ​:
Imunizados / Ratos tratados com veículo
 Média.
(dendrossoma)  Escore clínico de pico
04 Imunizados / Ratos tradados com PNC  Pontuação cumulativa da
doença.
05 Imunizados / Ratos pré-tratados com PNC
 14

MATERIAIS E MÉTODOS

 ISOLAMENTO DE RNA E PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

RNA de medula espinhal lombar foi extraída e purificada usando

reagente Tryzol

 02 mcg de RNA purificado foi corrido em gel de agarose para

confirmar a integridade do RNA isolado

 15

MATERIAIS E MÉTODOS

 PREPARAÇÃO DO TECIDO, LUXOL RÁPIDO AZUL E COLORAÇÃO H & E

 Os animais foram anestesiados e perfundidos com PBS em via intracardial.

 Medulas espinhais lombares foram imediatamente colhidas e pós-fixados

durante a noite a 4ºC

 Avaliação de desmielinização com Luxol coloração azul rápido

 Tecidos foram desidratadas numa série de álcool

 Secções de 5 mm de diâmetro - re-hidratadas e coradas com 0,1% Luxol

Fonte:
 Secções obtidas a partir da coluna vertebral lombar foram
http://pt.slideshare.net/adilatrub
 16

MATERIAIS E MÉTODOS
 Um total de vinte e um lâminas foram analisadas por grupo experimental foram

fotografadas, e quantificadas.

 A medida de desmielinização foi calculada

 Coloração H & E - secções coradas com Hematoxilina por 4 min e clareadas com

Xileno

 Secções foram lavadas e contrastadas com Eosina durante 1,5 min

 Sete Secções de área da lesão para cada animal www.renylab.ind.br

 17

MATERIAIS E MÉTODOS

 ESTUDOS IMUNOHISTOFLUORESCÊNCIA

 Medulas espinhais lombares foram colhidas como estudos histológicos e pós-

fixadas em paraformaldeído a 0,4% durante 3h

 Micrômetro

 Imunocoradas por anticorpos primários

 Lavadas com PBS

 Imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência

 18

MATERIAIS E MÉTODOS

 ANÁLISE ESTATÍSTICA
 Utilizado ANOVA one-way

 TukeyeKramer (pós-teste)

 Dados analisados:

 Histológico

 Expressão gênica

 Imunocoloração quantificada

 Teste t-student - Para comparar dados entre dois grupos experimentais

 19

RESULTADOS

FIG. 1
 20

RESULTADOS

 Nos ratos Lewis foram injetados i.p. as mesmas doses de PNC ou curcumina a partir

de dia 12 e 29

 Escore clínico de cada rato foi avaliado em intervalos de 24 horas durante dias após

a indução

 A administração diária de PNC durante o período recuperou significativamente os

animais

 A administração terapêutica de nano-curcumina polimerizado (PNC) melhora a

gravidade de ratos com EAE

 21

RESULTADOS

MEDULA ESPINHAL LOMBAR

DESMILIENZAÇÃO

FIG. 2a: A análise histológica da medula espinhal demonstrou

desmielinização reduzida nos animais tratados quando comparado com
o grupo com EAE não tratado
 22

RESULTADOS

Embora o tratamento
com o veículo
(dendrossoma) não
alterou o ponto de
desmielinização, o
tratamento com PNC
reduziu
significativamente a
desmielinização
FIG. 2B: comparação quantitativa da extensão da área de desmielinização em
diferentes grupos de animais
- 21 secções de cada grupo foram analisados
FIG. 2C: Veículo (dendrossoma) não alterou a densidade mielinização, mas PNC
01
 23

RESULTADOS

 O tratamento com PNC causou um decréscimo

no número de células imunes infiltradas e
vacuolização no SNC de ratos após o
tratamento em comparação com os animais do
grupo de EAE.

 Confirmou repressão do processo inflamatório

e imunológico por PNC sobre a EAE.

 O aumento da coloração de mielina dentro da

área da lesão apoia o eventual reforço do
reparoObs:
da 21
mielina
seções de por tratamento
cada grupo PNC.
foram marcados por um
patologista que desconhecia os grupos experimentais
Fig. 3.
 24

RESULTADOS

Para avaliar o efeito da PNC no nível da

mielinização na medula espinal lombar,

estudou-se:

a expressão de MBP: uma proteína da

mielina que é responsável pela sua

compactação e função normal; nestina:

um marcador de células estaminais

neurais. Olig2 e PDGFR-α: marcadores de

FIG. 8. tratamento PNC aumentou a expressão de genes marcadores para
células progenitoras oligodendrócitos.
reparação de mielina e células progenitoras.
 25

RESULTADOS

 A-> EAE diminuiu a expressão de MBP.

 A -> No grupo tratado PNC, o nível de expressão de MBP era ainda mais elevada do

que o grupo intacto.

 B -> No grupo com EAE, não houve uma alteração significativa na expressão de

Nestina, mas ao seguir o tratamento com PNC o nível de Nestina no RNAm estava

significativamente aumentada.

 C / D -> O tratamento com PNC aumentou a expressão de ambos Olig2 e PDGFR-α

EM comparação com o grupo de EAE.

 26

RESULTADOS

Pré-tratamento com PNC no

desenvolvimento de EAE. PNC
foi administrado diariamente a
partir do dia de imunização e
continuado até ao dia 29 pós-
indução.

O pico da pontuação média foi significativamente

menor que o grupo controle EAE. Depois disso, a
pontuação de EAE foi reduzido sem qualquer recaída.

FIG. 9. A administração profilática de PNC melhorou a gravidade das pontuações de EAE

 27

RESULTADOS

Compara a extensão da
desmielinização entre os
grupos de pré-tratamento da
EAE e do PNC.

O tratamento profilático com PNC

poderia preservar completamente o
conteúdo de mielina da medula espinal
lombar.
FIG. 10. Micrografias representativas de secções da medula espinhal
lombar coradas com Luxol azul rápido
 28

DISCUSSÃO
 O PNC reduziu o desenvolvimento da EAE quando administrada no início do desenvolvimento

de sintomas de EAE.

 A sua administração diária de PNC reduziu os ataques dos sintomas da doença.

 Curiosamente a curcumina na dose de 12,5 mg/kg/dia não reduziu as pontuações da EAE.

 Em um estudo anterior relatam que a curcumina reduziu pontuações de EAE em ratos Lewis quando

administrado em 100 e 200 mg / kg (Xie et al., 2011)

 A formulação como PNC aumentou significativamente a eficácia terapêutica da curcumina no

 29

DISCUSSÃO

 Demonstrou-se que o PNC regulou citocinas e promoveu a resposta do sistema imunitário

para a melhoria da doença, aumentando os fatores anti-inflamatórias que pode resultar na

melhoria dos EM.

 Como a inflamação tem sido provado como uma causa notável de EM (Oksenberg e Hauser, 2006)

 Fatores anti-inflamatórios foram aumentadas, enquanto genes pró-inflamatórias foram

significativamente diminuída.

 A curcumina foi anteriormente mostrado para controlar a inflamação (Okuda et al, 1995)
 30

DISCUSSÃO
 Avaliou-se o efeito de PNC sobre a expressão de alguns fatores neurotróficos e genes
marcadores de células progenitoras.
 Há possível relação entre a administração PNC e neuroproteção (remielinização) por meio de
fatores neurotróficos no conceito da EAE.
 Os nossos dados sugerem que o PNC poderia aumentar a expressão de MBP mesmo para
níveis mais elevados do que os animais intactos.
 A imunocoloração utilizando o anticorpo MBP confirmaram os dados de expressão de genes.
Encontrou-se também o aumento dos níveis de Nestin, Olig2 e PDGFR-α em ratos tratados
com PNC em comparação com animais de controle e com EAE.
 Pré-tratamento com PNC atrasou a ocorrência de sintomas de EAE, atenuou os sintomas e
impediu a recidiva da doença. A maioria dos pacientes com EM experimentam vários ciclos remitente-
recorrente da doença. Seria de grande ajuda para controlar os surtos da doença.
 31

DISCUSSÃO

 O estudo mostrou que:

 O PNC melhora a EAE;

 Impede a doença quando aplicado como pré-tratamento;

 Reduz a desmielinização;

 Muda o perfil de expressão de citocinas em favor dos mediadores anti-inflamatórios;

 Modulou a expressão dos genes envolvidos no controle de stress oxidativo;

 E aumenta os fatores tróficos e células progenitoras envolvidos em reparação de mielina.

 32

DISCUSSÃO

Estas descobertas são promissoras para avaliar o

PNC como um nova terapia para a EM e outras
doenças neuro-inflamatórias. É claro, há muito
mais estudos necessários para provar a aplicação
do PNC como um agente terapêutico no
tratamento de EM.
 33

REFERÊNCIAS
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