Um novo sistema de liberação oral do Interferon-β (INF- β)

pH-sensível para aplicação na esclerose múltipla

SAMARA ROSA PESSOA

Setembro de 2013
 RESUMO

Micropartículas sensíveis ao PH foram preparadas utilizando

trimetil-quitosano (TMC), poli (etileno-glicol) dimetacrilato
(PEGDMA) e ácido metacrílico (MAA), por polimerização em
suspensão sem radicais, para a distribuição oral de
Interferon-ß (INF-ß). As micropartículas foram
subsequentemente comprimidas em uma formulação de
comprimido oral adequada.
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 CONTEXTUALIZAÇÃO

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Fonte: www.youtube.com.br
 INTRODUÇÃO
Esclerose Múltipla (EM)
◦ Neurodegenerativa
◦ Crônica
◦ Efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC)
 Tremores
 Tonturas
 Perturbações visuais
 Fraqueza muscular
 Espasmos musculares
 Perda de sensibilidade
0  Impedimento de fala e depressão.
Fonte: Nolasco, 2012
 INTRODUÇÃO
 MEDICAÇÕES
◦ Glatirâmer: 20 mg, SC, 1x ao dia
◦ Betainterferona 1a: 22 mcg, SC, 3x por semana
◦ Betainterferona 1b: 300 mcg, SC, de 48/48h
◦ Fingolimode: 0,5 mg, por via oral, 1x ao dia

 Benefícios esperados
◦ Melhora sintomática.
◦ Diminuição da frequência e gravidade das recorrências.
◦ Redução do número de internações hospitalares.
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 INTRODUÇÃO
INTERFERON – ß (INF – ß)
◦ É a droga peptídeo mais eficaz e amplamente
utilizado para o tratamento de EM

◦ O efeito fundamental é baseado na redução da

resposta imunitária Fonte: www.medifitindia.com

◦ A dose é administrada por via parentérica - SC ou

IM
 Dor
 Risco de necrose tecidual
 Reações alérgicas

0 Baixa adesão do paciente


 Chances de infecção
 INTRODUÇÃO
Vias alternativas de distribuição – VO
◦ Desafios:
 Degradação enzimática pré-sistémica do peptídeo

 Fraca penetração através da membrana intestinal

 Absorção: intestino delgado - área alvo, desde que a forma de dosagem atinja
esse local intacto sem ser degradada / pH intestinal: 6,8 e pH gástrica 1,2.

 Translocação através da camada de muco: esta pode impedir severamente a

absorção, se o sistema de polímero não adere à camada de muco e libertar o

0 peptídeo simultaneamente.
 INTRODUÇÃO
 ESTRATÉGIAS:
◦ Encapsulamento de peptídeos: revestimento entérico
secos emulsões, lipossomas, microesferas e
nanopartículas.

 PEGilação de proteínas:
◦ Estabilidade da proteína
Fonte:
◦ Aumento do tempo de retenção www.youtube.com.br
◦ Polímero de polietileno-glicol (PEG) protege a superfície
da proteína a partir de agentes de degradação.
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 MATERIAIS E MÉTODOS
 MATERIAIS
Quitosana (CHT)

PEG (PM 4000 g / mol)

MAA

Iodeto de metila

Polietileno Glicol Diacrilato (PEGDA)

Ácido Sulfônico

0 Mucina (tipo 2)
 MATERIAIS E MÉTODOS
 MATERIAIS
Azobis-isobutironitrilo (AIBN)

Huminsulin-R (Actrapid®) – 100Ui/mL

INF-ß 1a (Rebif®)

N-metil-2-pirrolidona

Kit ELISA Verikine™ Human INF-ß

Reagentes de grau analítico

Coelhos NZW pesando uma média de 2,5 kg
0 (12-15 semanas de idade)
 MATERIAIS E MÉTODOS
 Síntese de trimetil-quitosano (TMC)
◦ Processo de três estágios.

 Síntese de PEG-dimetacrilato (PEGDA)

◦ Utilizando ácido sulfônico como catalisador e hidroquinona
como um inibidor de radicais.

Preparação de partículas poliméricas de TMC-PEGDA-

MAA
◦ Partículas copoliméricas sensíveis ao pH foram preparadas pela
1 técnica de polimerização em suspensão de radicais livres.
 MATERIAIS E MÉTODOS
Aplicação de um design Box-Behnken para a
formulação de partícula polimérica
◦ Concepção de uma formulação ideal
◦ Variáveis independentes
 Concentração TMC
 Quantidade de reticulação

◦ Variáveis de formulação
 Resposta de libertação de fármaco em gástrico e intestinal
 Tamanho médio de partícula
 Respostas fraccionais de liberação
1
 MATERIAIS E MÉTODOS
O modelo de design gerado 13 formulações foram avaliadas,
com o objetivo de adquirir alta importância científica estatística

1
 MATERIAIS E MÉTODOS
Refletância-Fourier
total atenuada
transforma espectroscopia infravermelha
(ATR-FTIR)
◦ Espectros ATR-FTIR foram registrados para monómeros, polímeros e
as partículas resultantes copoliméricas.

O tamanho das partículas e potencial zeta -

análise de partículas poliméricas
◦ Partículas copoliméricas preparadas após liofilização
◦ As partículas copoliméricas foram deixadas no respectivo meio
1 ◦ durante 2 h para avaliação de diferentes condições de pH
 MATERIAIS E MÉTODOS
 Análise porosimétrica
◦ Mantidos em tampões gástrico e intestinal USP durante
2 h, para o polímero reagir com o respectivo pH
◦ Análise de porosimetria: prepararam-se comprimidos de
4 mm de diâmetro.

Fase 1: Estágio de desgaseificação

Fase 2: Absorção e dessorção cumulativa para
análise precisa da área de superfície, volume de
poro, tamanho de poro
1
 MATERIAIS E MÉTODOS
A análise morfológica
◦ Liofilizou-se mais uma vez para determinar as
características morfológicas
◦ Amostras foram revestidas por pulverização catódica
utilizando o composto de ouro
◦ Microscópio eletrônico, - empregando uma taxa de
aceleração de elétrons de 20 kV, para produzir
imagens de alta resolução das partículas.

1
 MATERIAIS E MÉTODOS
 Estudos de Mucoadesão
◦ Preparada solução de mucina no fluido intestinal (pH
6,8) incubada com partículas copoliméricas.
◦ Também foi analisada a pH 1,2

◦ Equação para determinação da interação entre as

partículas e mucina

1
 MATERIAIS E MÉTODOS
A insulina e INF- carga nas partículas poliméricas
◦ Dispersão de 1 g de partículas poliméricas em 5 mL de solução de
insulina durante um período de 8 h, com redução gradual de pH.

◦ A concentração de INF-ß no filtrado foi analisada usando Kit ELISA

Verikine™ Human INF-ß

 Estudos de libertação in vitro

◦ Estudos de libertação de drogas in vitro foram realizadas Todas as
formulações de design experimental Box-Behnken foram em ambas
as condições de pH gástrico e intestinal

◦ 2 comprimidos com 100 UI de insulina de cada) foram colocados em

1 50 mL de simulado gástrico (pH 1,2) e intestinal (pH 6,8)
 MATERIAIS E MÉTODOS
Estudos em animais in vivo
◦ 09 coelhos foram divididos em 3 grupos, tendo 3 coelhos cada um,
todos pesando 2,5 kg ± 0,05 kg

Grupo 1 (grupo experimental): sonda gástrica, carga total de

INF-ß 44mg

Grupo 2 (controle): dose de placebo

Grupo 3 (avaliação do produto comercial): administradas por via
SC com a formulação conhecida do INF-ß 44mg, 3 injeções por
semana 48/48h
As amostras de sangue foram COLETADAS a 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10,12 e 24h após a
1 administração respectiva da formulação. Todos os coelhos foram usados ​uma vez no estudo,
e foram sacrificados após a conclusão dos estudos.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi claramente evidente que as partículas
maiores foram obtidas em baixo pH do meio
gástrico em comparação com o meio intestinal
(pH 6,8).
O tamanho de partícula mais baixa foi
observada em meio intestinal.
O índice de polidispersibilidade (PDI) das
partículas no meio gástrico apresentado valores
1 muito maiores que no meio intestinal.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Éevidente que o sistema de libertação
polimérica possui um maior tamanho de poro e
área de superfície no meio intestinal.

2
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A pH 1,2, as partículas parecia
ser bem aglutinadas em
grandes massas de forma oval
a forma longitudinal, com
poucos ou nenhuns poros
visíveis entre as partículas.

A pH 6,8, as partículas
praticamente explodiram na
sua morfologia, mostrando-se
maciças, inchadas e dispersas.
Fig.: Partículas poliméricas a ampliação de
10000× que mostra (A) em meio gástrico (pH
1,2) e (b) em meio intestinal (pH 6,8).
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em pH intestinal, a
formulação
optimizada
demonstrou uma
muco adesão 23,3%,
em comparação com
um muco adesão 3%
observado no pH
gástrico
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Uma relação proporcional pode ser deduzida entre
o tamanho de partícula e a eficiência de carga de
fármaco:
◦ A porcentagem de agente de reticulação e as
concentrações de TMC foram aumentadas na formulação
-> a carga de proteína aumentou substancialmente.

Pode concluir-se que a porcentagem de agente de

reticulação utilizada tem um impacto significativo
sobre a quantidade de fármaco libertado em ambas
as condições gástricas e intestinais
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A formulação optimizada para entrega eficaz de

peptídeo foi, então, escolhido pelo Box-Behnken
como formulação 7. A sua retração no ambiente
gástrico, tornando liberação mínima, foi o mais
desejável. Além da proteção do peptídeo para a
capacidade máxima possível e libertando a droga
uma quantidade substancial no ambiente
intestinal.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O sistema copolimérico de partículas
desenvolvido foi entregue com sucesso INF,
através de VO, com concentrações de pico ao
longo de 24 h de duração maior do que a
formulação de comparação subcutânea (SC).

Observou-se claramente que a formulação oral

preparada forneceu resultados notáveis maior
do que a formulação comercial SC INF.
 CONCLUSÕES
 Formulação 7 foi considerado ideal com base na resposta
gerado para as variáveis dependentes - tamanho de partícula
e a libertação de insulina em diferentes condições de pH
A insulina foi utilizada como o fármaco peptídico modelo para
a concepção e formulação estudos posteriores foram
realizados com a formulação copolimérico optimizado para INF
in vitro e in vivo libertação análise.
O perfil in vitro de liberação estabeleceu uma natureza pH
sensível eficiente do sistema desenvolvido
O sistema de partículas carregadas de INF demonstrou ainda
mais notável libertação de droga in vivo, maior do que a
formulação comercial SC (Rebif)
 CONCLUSÕES

O sistema de partículas
copolimérico desenvolvido tem um
potencial significativo para a
aplicação na entrega oral de INF
em pacientes com EM.
 REFERÊNCIAS
Arduini, R.M., Strauch, K.L., Runkel, L.A., 1999. Characterization of a soluble ternarycomplex formed
between human interferon-1a and its receptor chains. ProteinSci. 8, 1867–1877.
Chiu, A.W., Ehrmantraut, M., Richert, N.D., Ikonomidou, V.N., Pellegrini, S., McFar-land, H.F., Frank, J.A.,
Bagnato, F., 2007. A case study on the effect of neutralizingantibodies to interferon beta 1b in multiple
sclerosis patients followed for 3years with monthly imaging. Clin. Exp. Immunol. 150, 61–67.
Cruise, G.M., Hergre, O.D., Scharp, D.S., Hubbell, J.A., 1998. A sensitivity study of thekey parameters in
the interfacial photopolymerisation of poly(ethylene glycol)diacrylate upon porcine islets. Biotechnol.
Bioeng. 57, 655–665.
Domard, A., Rinaudo, M., Terrassin, C., 1986. New method for the quaterinization ofchitosan. Int. J. Biol.
Macromol. 8, 105–107.Fischer, A., Heesen, C., Gold, S.M., 2011. Biological outcome measurements for
behav-ioral interventions in multiple sclerosis. Ther. Adv. Neurol. Disord. 4, 217–229.
Fish, R.E., Brown, M.J., Danneman, P.J., Karas, A.Z., 2008. Anesthesia and Analgesia inLaboratory Animals,
2nd ed. Academic Press, New York.
Foss, A.C., Peppas, N.A., 2004. Investigation of cytotoxicity and insulin transport ofacrylic-based
copolymer protein delivery systems in contact with caco-2 cul-tures. Eur. J. Pharm. Biopharm. 57, 447–
455.
Hemant, K.S.Y., Shibakumar, H.G., 2010. A comparative study of N-trimethyl chi-tosan chloride and
chitosan microparticles as novel carriers for the delivery ofhypertensive drug. J. Pharm. Res. 3, 809–813.
Jongen, P.J., Hengstman, G., Hupperts, R., Schrijver, H., Gilhuis, J., et al., 2011. Drugadherence and
multidisciplinary care in patients with multiple sclerosis. BMCNeurol. 11, 40.