Techniques de concentration des selles

Par
SALAMI Aichat Yabo
DES 1 Biologie Clinique
2019-2020

1
 OBJECTIFS

• Définir une technique de concentration des selles

• Décrire les techniques de concentration des selles

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 PLAN

Introduction

1- Généralités

1-1- Définition

1-2- But

2-Techniques de concentration

Conclusion

3
INTRODUCTION
INTRODUCTION

4
 INTRODUCTION
• Techniques de concentration l’examen parasitologique des selles comme le
précise l’actuelle Nomenclature des Actes de Biologie Médicale (NABM).

• Choix des techniques est orienté par les renseignements obtenus lors de
l’interrogatoire du patient, l’examen clinique et les examens biologiques.

• Méthode de concentration: Méthodes physiques ou monophasiques

Méthodes physicochimiques ou diphasiques

Techniques combinées

Techniques spécifiques 5
GENERALITES
GENERALITES

6
 GENERALITES

Définition :
 A partir de la grande quantité de matières fécales recueillies, d'obtenir dans un
faible volume les œufs, larves, kystes voire formes végétatives fixées de parasites
par élimination des résidus de la digestion.

 Pour ce faire, on joue sur les densités et affinités différentes de ces résidus et des
parasites recherchés.

7
 GENERALITE

• But :

Réunir dans un faible volume les éléments parasitaires initialement dispersés dans
une grande masse de selles

→ Augmenter les chances de mettre en évidence le parasite

→ Faciliter le diagnostic

8
Techniques
Techniquesde
deconcentration
concentrationdes
desselles
selles

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 TECHNIQUES DE CONCENTRATION DES SELLES

• Mise en œuvre dune technique de concentration

- Concentration sera réalisée sur des selles non fixéés ou éventuellement

recueillies dans un fixateur

-Techniques de concentration , qui ne préservent pas les formes végétatives de

protozoaires pourront s’éffectuer sur des selles non fixées conservées jusqu’à
4jours en milieu réfrigéré

-Méthode de concentration idéale doit éliminer le maximum de débris, conserver

un maximum de parasites, être de réalisation rapide et de cout réduit 10
 TECHNIQUES DE CONCENTRATION DES SELLES

• Mise en œuvre dune technique de concentration

- On veillera à prélever à plusieurs endroit en profondeur et en surface pour tenir

compte des différentes localisations des parasites intestinaux (parasites coliques
seront plutôt retrouvés en surface, les parasites vivant dans l'intestin grêle en
profondeur),notamment par grattage de la surface pour les selles moulées.

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 I-METHODES MONOPHASIQUES

On distingue deux techniques

Techniques de sédimentation
Techniques par flottation

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 I-METHODES MONOPHASIQUES
• Principe : dilution des selles dans un liquide de densité inférieure à celle des
éléments parasitaires qui sédimentent

• Avantages

- toute la masse de selle est traitée

• Inconvénient : temps de réalisation long (plusieurs sédimentations)

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 I- METHODES MONOPHASIQUES
A) Méthodes monophasiques par sédimentation

• 2 méthodes monophasiques par sédimentation

- Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée

- Méthode de Van Someren et Grégoire en colonne haute

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 I- METHODES MONOPHASIQUES
A) Méthodes monophasiques par sédimentation

1- Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée

-Intérêt : technique de terrain est employée pour rechercher les œufs de

Schistosoma mansoni mais permet aussi de trouver œufs d'Ascaris non fécondés et
larves d'anguillule.

- Inconvénients : l'examen microscopique peut être rendu difficile par la présence de

certains résidus.
15
 I- METHODES MONOPHASIQUES
A) Méthodes monophasiques par sédimentation

1- Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée

- Technique:

5 gde selles sont dilués dans 300 ml d'eau glycérolée à 0,5%.

3 sédimentations successives en verres à pied d'une durée de 1 heure, 45 minutes

puis 30 minutes.

Les œufs de schistosomes sont plutôt en superficie du sédiment mais il est

recommandé d'effectuer des prélèvements à différents niveaux.
16
 I- METHODES MONOPHASIQUES
A) Méthodes monophasiques par sédimentation

2- Méthode de Van Someren et Grégoire en colonne haute

-Intérêt : technique vétérinaire est utilisée par certains médecins pour rechercher
essentiellement les œufs de grande douve.

- Inconvénients: Nécessité d'utiliser un appareillage spécial c'est-à-dire un tube de

verre de 1 cm de diamètre intérieur et de 2,10 m de haut.

En bas de ce tube un tuyau de caoutchouc de quelques centimètres peut être fermé

par une pince. Il relie le grand tube de verre à un autre tube de verre, court, muni d'un
robinet. 17
 I- METHODES MONOPHASIQUES
A) Méthodes monophasiques par sédimentation

2- Méthode de Van Someren et Grégoire en colonne haute

Technique :

 Grand tube est rempli de solution de Teepol à 1 % en évitant une forte agitation (bulles).

4 g de selles diluées dans 36 ml de cette même solution sont tamisées à travers la passoire
ordinaire voire à travers une deuxième passoire à mailles plus fines (un tiers de millimètre de
côté). Le filtrat est versé lentement dans le liquide de la colonne.

 Après 20 min exactement la pince du tuyau en caoutchouc est serrée et, au robinet, on recueille
quelques gouttes de liquide où se sont condensés les œufs de douve particulièrement denses
(densité : 1,2). 18
 I-METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

Principe : dilution fécale dans un liquide de densité supérieure à celle des éléments parasitaires
qui surnagent.

Méthode de Willis
Méthode de Faust simplifiée
Méthode de Janeckso et Urbanyi

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Principe général Nom de la Spécificité Points Avantages Inconvénients/li
des méthodes méthode et importants à mites
principaux maitriser
réactifs
           
Méthodes Willis(solution Œufs -Temps de -Technique -Lecture
physique par saturée de NaCI ) d’helminthes contact avant simple, facile à immédiate
flottation densité (d)  1,20 -Très bons lecture à limité mettre en œuvre -Non réalisable
  résultats pour entre 15 et 30 (matériel à usage sur selles riche en
  œufs minutes unique, produits lipide (lecture
d’ankylostomidés -Lecture non corrosifs) impossible)
et d’H nama immédiate -Préparation -Ne concentre pas
-Ne détecte pas (risque de claire et facile à tous les œufs (par
les œufs les plus cristallisation) lire  exemple douves
lourds schistosomes ,
ascaris infertiles )
Non adapte aux
protozoaires

20
 I-METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

1- Méthode de Willis

Technique :

- Diluer progressivement une noix de selles avec 5 volumes de réactif

-Tamiser

- Remplir presque entièrement un tube à centrifuger

- Centrifuger à 2 500 t/mn pendant 3 mn

- Prélever en surface avec un agitateur aplati

- Déposer sur une lame, mettre une lamelle 21

 METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

1- Méthode de Willis

Figure 1 : Technique Willis

22
 I-METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

2-Méthode de Faust et dérivés

Technique :
- selles diluées au dixième environ dans une solution saturée de sulfate de zinc (sulfate
de zinc 331 g, eau qsp 1000 ml),
-Tamisées et centrifugées environ une minute à 2300 tours/minute.
- Dès l'arrêt de la centrifugation, on prélève à l'anse métallique la couche superficielle
qui contient les œufs et on la dépose sur une lame pour examen.

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Principe Nom de la Spécificité Points importants Avantages Inconvénients/lim
général des méthode et à maitriser ites
méthodes principaux METHODES MONOPHASIQUES
réactifs B) Méthodes monophasiques par flottation
 
Méthodes          
physique par Faust et dérivés Technique peu Densité important Plus sensible que la Morphologie
flottation Sulfate de zinc à sélective pouvant vérifiée par pesée méthode de Willis altérée de certains
plusieurs être une technique de précision ou par Couplage possible à éléments
densités standard densitomètre une technique parasitaire aux
d = 1,18 (33%) , Selon la /les étalonné diphasique densités les plus
1,2,1,27et /ou densité(s) utilisé(s), Technique délicate augmentent sa élevées
1,44 (faust) possibilité de ou recueil du film sensibilité ou en cas
détecter les kystes superficiel (à de selles riche en
voire forme effectuée dés la fin lipides
végétatives de de la Existence de kids
protozoaires œufs centrifugation) commercialisés pour
d’helminthes   usage vétérinaire
Concentre bien les   (densité  1,18 ou1,2)
œufs d’oxyures    

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 I-METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

2-Méthode de Faust et dérivés

Technique :
- selles diluées au dixième environ dans une solution saturée de sulfate de zinc (sulfate
de zinc 331 g, eau qsp 1000 ml),
-Tamisées et centrifugées environ une minute à 2300 tours/minute.
- Dès l'arrêt de la centrifugation, on prélève à l'anse métallique la couche superficielle
qui contient les œufs et on la dépose sur une lame pour examen.

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 I-METHODES MONOPHASIQUES
B) Méthodes monophasiques par flottation

3-Méthode de Janeckso-Urbanyi
Technique :
- 3 à 5 g de selles sont triturés dans 20 ml de la solution iodomercurique
- Pour préparer la solution : dissoudre l'iodure dans un peu d'eau, ajouter le biiodure en
remuant, puis après dissolution complète, ajouter le reste de l'eau.
- La densité obtenue est de 1 440. Après tamisage, le filtrat est centrifugé à 2 500
tours/mn pendant 3 à 4 minutes.
- La couche superficielle recueillie à l'aide d'une anse ou d'une baguette de verre aplatie
en spatule est examinée au microscope dans le quart d'heure qui suit. 26
Figure 2 : Technique Janeschso et Urbanyi modifiée
27
Principe Nom de la méthode Spécificité Points importants Avantages Inconvénients
général des et principaux à maitriser
méthodes réactifs
 
Méthodes
physique          
par Janeckso Urbanyl Technique de choix Prélèvement Bien adapté aux Très peu utilisée car
flottation lodomercurate de pour la détection des immédiat :de la œufs lourds présence de sels de
potassium de densité œufs lourds(F couche mercure corrosifs toxique
1,44 hepatica, schistosomes superficielle ou via et allergisants :danger
  ankilostomidés ,ténias, la lamelle posée sur pour le personnel
  Hyménolépis le ménisque (risque problème par l’élimination
  sp. ;oxyures , de sédimentation des déchets
  trichocéphales) et des parasite) Déformation de certains
  larves d’helminthes. œufs (oxyures,
Peut concentrer les schistosomes)
oocystes de coccidies Non performance pour les
kystes
Non réalisable sur selles
riches en lipides

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 II - METHODES DIPHASIQUES

Utilisent les propriétés de l'éther :

- qui d'une part, est un solvant des lipides
- et d'autre part n'est pas miscible avec l'eau
Principe :
2 phases non miscibles sont utilisées :
- 1 phase aqueuse hydrophile permettant la dilution fécale, d'une densité inférieure
à celle des éléments parasitaires
- 1 phase organique lipophile où se fait la dissolution des lipides à éliminer.
- Permettant de concentrer les éléments fécaux dans le culot 29
II - METHODES DIPHASIQUES

Figure 3: Technique diphasique

30
 II - METHODES DIPHASIQUES

Nous distinguons:
- Méthode de Bailenger
- MIF concentration
- Méthode de Ritchie simplifiée
-Méthode de Telemann modifiée par Rivas

31
 II - METHODES DIPHASIQUES

Technique:
- Dans un verre à pied : diluer progressivement avec un agitateur 1 volume de selles
dans 10 volumes de réactif
- Laisser sédimenter quelques secondes ou tamiser sur un tamis phase organique
métallique à larges mailles
- Verser dans un tube à centrifuger, le remplir à moitié débris

32
 II - METHODES DIPHASIQUES

Technique:
- Ajouter de l'éther dans la proportion 1/3 - 2/3 (laisser vide le haut du tube)
phase aqueuse
- Agiter fortement puis centrifuger à 2000 t/mn pendant 2 mn
- Eliminer les 3 couches superficielles par retournement brusque
- Prélever le culot avec une pipette Pasteur culot à examiner
- Le déposer sur une lame, mettre une lamelle.

33
Figure 4 : Technique diphasigue
34
 II - METHODES DIPHASIQUES

1- Méthode de Bailenger

Phase aqueuse: Tampon acéto-acétique à pH5

Phase organique: éther

35
Principe général Nom de la méthode Spécificité Points importants à Avantages Inconvénients/limites
des méthodes et principaux maitriser
réactifs
Méthodes Bailenger / Ether ou Technique peu Temps de Bon rendement Non adapté à la détection
physicochimiques Bailenge/ Acétate sélective pouvant sédimentation et bonnes des formes végétatives de
diphasiques ethyle Tampon être une technique maximal d’une performances, protozoaires.
  acéto-acétique ph standard minute pour éviter la facile à mettre Mauvaise concentration pour
et solvan ether ou Adapté pour les perte des parasites en œuvre. les œufs d’oxyures piégés
acétate d’éthyle kystes de les plus lourds Kits dans les couches de débris à
protozoaires, les (embryophores de commercialisés l’interface des phases
coccidies et les taenias, simplifiant aqueuses et organique.
cristaux de Charcot- schistosomes, etc) l’utilisation, à Techniques utilisant l’acétate
Leyden Attention à l’ether compléter par le d’éthyle à la place de l’ether
Concentre d’un toxique par solvant. moins performante et plus
facteur 10 par inhalation et Petit culot, difficile à lire.
rapport à l’examen inflammable mais concentre bien Toxicité de l’ether par
direct pour la augmentant le les protozoaire et inhalation et inflammable
détection des rendement et acceptable pour Elimination spécifique des
protozoaires et facillitant la lecture. déchets Gene à la lecture si
helminthes. les oeufs et nombreux cristaux ou
larves cellulose

36
 II - METHODES DIPHASIQUES

1- Méthode de MIF : Merthiolate lode Formol

Phase aqueuse: MIF

Phase organique: éther

37
Principe Nom de la Spécificité Points importants Avantages Inconvénients/limites
général des méthode et à maitriser
méthodes principaux II - METHODES DIPHASIQUES
réactifs
  MIF Technique peu sélective MF et solution MIF : Non adaptée à la détection
Méthodes (Merthiolate pouvant etre une d’iode à mélanger - Fixation des des formes végétatives de
physicochimi lode technique standard extemporanément selles protozoaires
ques Formol/Ether Memes indications que - Identificatio Concentration irrégulière
diphasiques ou Acétate la methode de n facilitée des kystes
  d’Ethyle ou Bailenger des Mauvaises concentration
lodésine / Concentration des protozoaire des œufs d’oxyures (mais
Acetate kystes de protozoaires s par la meilleures qu’avec le
d’éthyle Bonne performance coloration Bailenger car l’élimination
  pour détection des des noyaux des débris est moins
  œufs de schistosomes - Existence importante)
  et ascaris non fécondés de kits Culot un peu plus gros que
  commercial Bailenger
  isés
 

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Principe Nom de la Spécificité Points importants Avantages Inconvénients/limites
général des méthode et II - METHODES DIPHASIQUES
à maitriser
méthodes principaux réactifs
  MIF (Merthiolate MIF MF : Format et merthiolate
Méthodes lode Formol/Ether coloration : toxiques.
physicochimi ou Acétate d’Ethyle Conservation Alternative : mélange
ques ou lodésine / des monoéthanol amine,
diphasiques Acetate d’éthyle échantillons éosine, éthanil et acétone
    positifs Formol toxique par
  (coprothèque) inhalation
sans altération Lodésine et acétate d’éthyle
  des parasites (kits commercialisés) ;
  Fixation des alternatives moins toxiques
  selles après que MIF et éther mais
  émission pour moins performantes en
une diagnostic et ne permettant
observation pas la conservation à long
retardée des terme des échantillons
formes positifs.
végétatives

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 II - METHODES DIPHASIQUES

3- Méthode de Ritchie simplifié

Phase aqueuse: eau physiologique formolée a 10%

Phase organique: éther

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Principe Nom de la Spécificité Points Avantages Inconvénients/limites
général des méthode et II - METHODES DIPHASIQUES
importants à
méthodes principaux réactifs maitriser
  Ritchie simplifié Idem Bailenger Pas de Mauvaise concentration des
Méthodes Formol 10% ou MIF techniques œufs d’oxydures (mais
physicochimi   Bonne commercialisés mailleures qu’avec le
ques   concentration Baillenger car l’élimination
diphasiques   des œufs des débris est moins
    d’ascaris et importante)
  shistosomes et Toxicité lié à l’utilisation du
  kystes de formol ou de éther
protozoaires

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 II - METHODES DIPHASIQUES

4- Méthode de Telemann modifiée par Rivas

- Avantages Facile à pratiquer, rapide, cette technique concentre bien les parasites
les plus courants (Giardia, Entamœba et œufs de trichocéphale). La coque des
kystes d'Entamœba histoh/tica se dédouble lors de la centrifugaron ce qui est un
argument diagnostique intéressant.

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 II - METHODES DIPHASIQUES

4- Méthode de Telemann modifiée par Rivas

- Avantages Facile à pratiquer, rapide, cette technique concentre bien les parasites
les plus courants (Giardia, Entamœba et œufs de trichocéphale). La coque des
kystes d'Entamœba histoh/tica se dédouble lors de la centrifugaron ce qui est un
argument diagnostique intéressant.

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 II - METHODES DIPHASIQUES

4- Méthode de Telemann modifiée par Rivas

Inconvénients : Les œufs de bilharzies, d'ascaris ou de grande douve restent dans la

couche lipophile: c'est donc une méthode à déconseiller dans les pays où sévissent ces
parasitoses.
Technique : Aucune particularité n'est à signaler par rapport à la technique générale
des concentrations diphasiques.

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 III – TECHNIQUES COMBINEES

-Combinent méthode de flottation et diphasique

-Excellents résultats
-Ex : Technique de Junod modifiée
-Les méthodes les plus intéressantes pour la diversité des kystes ou œufs concentrés
laissent souvent à examiner un culot relativement important

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 III – TECHNIQUES COMBINEES

Technique de Junod modifiée

- Avantages: statistiques publiées par l'auteur de cette méthode montrent sa
productivité. C'est l'une des méthodes les plus intéressantes tant pour les
recherches d'œufs que pour celles de formes végétatives ou kystes de protozoaires.
- Inconvénients : technique nécessitant 5 centrifugations demande un temps assez
long. D'autre part l'utilisation d'une solution d'iodo-mercurate présente les
inconvénients (solution toxique et corrosive).

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 IV– METHODES SPECIFIQUES
1- Méthode par éclaircissement de kato
Principe : met en évidence les œufs d’helminthes dans une quantité relativement
importante de selles; confection d'un frottis épais que l'on éclaircit
Technique :
- Déposer sur une lame un gros petit pois de selles
- Appliquer un morceau de Cellophane imbibé de réactif sur les selles
- Appuyer la lame à l'envers sur du papier filtre
- Laisser 1 h à la température du laboratoire ou 30 mn sous une lampe
- Lire sans attendre
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Principe général Nom de la Spécificité Points Avantages Inconvénients/limites
des méthodes méthode et importants à
principaux maitriser
IV– METHODE
réactifs PAR ECLAIRCISSEMENT DE KATO
  Kato Technique Lecture Bon résultats Non adaptée aux
Méthode par Glycénine, vert sélective immédiate des pour œufs protozoaires (sauf les
éclaircissement de malachite à Spécifique pour lames après la d’helminthes coccides)
3% recherche des fin de la phase qui se Possibilitéde déformation
  œufs d’éclaircisseme concentre mal des gros œufs
d’helminthes nt des selles : par les Non adaptée aux selles
  Détecte risque de non- techniques liquides
  facilement les visualisation classiques
  sporocytes et les des œufs d’H, d’enrichisseme
  oocystes de nan, nt
  coccidies d’ankylostomid Possibilité de
  és, de quantification
schistosomes si pesée du
au cours du prélèvement
temps de selles

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 IV– METHODES SPECIFIQUES
2- Méthode de Baermann et Lee :
Principe : Les larves rahbditoïdes d'anguillule ont un hydrothermotropisme positif. En
mettant en contact des selles contenant des larves avec de l'eau chaude celles-ci seront
attirées vers l'eau où elles seront facilement repérées
Technique de Baermann
-De l'eau chauffée à 45° est versée dans l'entonnoir jusqu'à mi-hauteur. La passoire
métallique est remplie de selles, pâteuses de préférence. Lorsque la passoire est placée
dans l'entonnoir les selles doivent affleurer le niveau de l'eau chaude.
- 2 à 3H plus tard, l'eau est soutirée soit dans une boîte de Pétri que l'on examine à
un fort grossissement de loupe binoculaire soit dans un tube à centrifuger. 49
 IV– METHODES SPECIFIQUES
2- Méthode de Baermann et Lee :
Technique de Baermann :
-Après 5 minutes de centrifugaron à 1500 à 2000 tours/minute, on regarde le culot.

Résultat : Si les selles sont assez récemment émises, si leur consistance permet la
circulation des larves, les chances de déceler ces dernières sont considérablement
augmentées par rapport aux méthodes de concentration habituelles.

50
 IV– METHODES SPECIFIQUES
2- Méthode de Baermann et Lee:

Figure 6 : Technique Baermann et Lee

51
Principe Nom de la
général des
IV–
méthode et
Spécificité
METHODES Points
SPECIFIQUES
importants à
Avantages Inconvénients/limites

méthodes principaux maitriser

réactifs 1- Méthode de Baerman:
  Baermann Technique Durée minimale Adaptée à la Non réalisable sur selles
Technique sélective de 3heures recherche des liquides
spécifique pour   Spécifique pour Durée variable larves Pas de matériel à l’usage
larves   recherche de en fonction de rhabditoides unique, donc nécessité de
d’helminthes   larves la consistance d’Heiminthes nettoyage et stérilisation du
  d’anguillules de la matrice et en particulier matériel
  de la larves
  température d’anguillule
Idéalement
température
maintenue à
30°C
Utilisation
d’eau stérile
(contamination
par des laves de
Rhabditis)

52
 IV– METHODES SPECIFIQUES
1- Méthode de Graham:

Scotch test anal ou Test de Graham : rare de trouver ces œufs

dans les selles, car la femelle vient pondre la nuit sur la marge de
l'anus. On fera un prélèvement anal le matin avant défécation et
douche
Principe: Récolte des œufs d’oxyure déposés sur les plis anaux
pendant la nuit par la femelle gravide, au moyen de cellophane
adhésive et d’un tube ou abaisse langue
Ce test peut également mettre en évidence les œufs de Taenia
53
 IV– METHODES SPECIFIQUES
1- Méthode de Graham:
Technique:
-appliquer un morceau de Cellophane adhésive (scotch
transparent) de la longueur d'une lame sur les plis anaux, à l'aide
d'un abaisse-langue.
- coller le scotch sur la lame en évitant de faire des plis (sinon
enlever le scotch et déposer une goutte de toluène avant de le
recoller)
- observer au microscope, le scotch servant de lamelle
Cette technique permet aussi de découvrir des œufs de ténia. 54
CONCLUSION
CONCLUSION

55
 CONCLUSION

• Augmenté la sensibilité de l’examen microscopique

• Selon NABM, un EPS standard doit comporter obligatoirement un état frais, un

examen direct après coloration et un examen après une concentration par deux
méthodes de routine (physique et physicochimique)

• Choix des techniques de concentration est défini par le biologiste.

• Utiliser systématiquement une technique de routine dite «  standard » associée à

une ou plusieurs techniques spécifiques en fonction du contexte épidémiologique

56
 REFERENCES

• ANOFEL. Parasitologie et mycologie médicale .

• Méthodes de laboratoire en parasitologie intestinale cahier de stage par Karine

Thivierge 2014

• Universites francophones copro-parasitologie pratique. Intérêt et méthodologie I

Notions sur les parasites du tube digestif JEAN-Jacques rousset association
africaine de microbiologie et d'hygiène alimentaire

57