Josefina Lozano Guajardo

Carlos Jesús Ruiz Amaro

Noviembre.2010
 Las células sufren alteraciones moleculares mientras el
organismo envejece.
Existen vías conservadas que modulan el
envejecimiento como la señalización de insulina,
tolerancia al estrés oxidativo y la detección de
nutrientes.
El envejecimiento y otros
procesos del desarrollo como la
diferenciación, apoptosis y
gametogénesis, están asociados a
cambios epigenéticos
característicos a nivel celular, que
incluyen la metilación del DNA y
las modificaciones
postraduccionales de las histonas
 Sir2
Silencing Information Regulator 2
Establece y mantiene el silenciamiento en las regiones de heterocromatina en los
telomeros, rDNA y el loci del mating type (HM), mediante la desacetilación de la
lisina 16 de la H4

Hiperecombinación
SIR2+++ + vida

SIR2 + ERCs
+ envejecimiento
pero
- Recombinación
FOB1-
FOB1 - ERCs
+ vida
 Se investigó los cambios en las modificaciones de
las histonas y la cromatina relacionados con la edad.

 Los resultados muestran que la cromatina es un

blanco critico de Sir2 en la regulación de la
duración de la vida e indican que Sir2 suprime el
envejecimiento en levaduras a través de histonas
blanco localizadas cerca de los telómeros.
Cambios en la modificación de histonas en
células viejas

• Envejecimiento evidente por aumento de cicatrices y copias de rDNA

• Modificaciones de histonas asociadas con transcripción de genes,

reparación de DNA y condensación de cromosoma, por Western Blot

•Niveles de RNA de Sir2 sin cambio, lo que indica cambios

postraduccionales
Los cambios en la cromatina se localizan
en regiones silenciadas

• ChIP para identificar

incrementos de H4K16ac y
decrementos de Sir2

• Los mas afectados son los

elementos X de los
telómeros
• El incremento de H4K16ac, decremento en la abundancia de
histonas y la disminución de Sir2 en las células de edad
avanzada están asociadas con una desrepresión transcripcional
en locus especifico cerca de los telómeros.
 Sas2 tiene efectos opuestos en H4K16ac y la
duración de la vida comparado con Sir2
 Sas2 es la principal acetiltransferasa de H4K16, por
lo tanto su deleción deberá alargar la vida.

 El alargamiento de vida es debido a la mejora en la

desacetilación de H4K16
 Sir2 y Sas2
modulan de forma
antagonista la
duración de la
vida, regulando
H4K16ac e
histonas en
telómeros.

Sas2 promueve
degradación de
Sir2

• Sas2 modula los cambios en la cromatina en las células viejas.

• Células sas2Δ no muestran incrementos en H4K16ac, decrementos en

histonas o pérdida de Sir2.

• Análisis por Western confirma que la deleción de SAS2 reduce la abundancia

de H4K16ac y estabiliza las histonas y Sir2 en células viejas.
 Mutaciones en H4K16 y H3K56 resultan
en acortamiento de la vida
H4K16ac actúa como un sustrato clave de Sir2 en la oposición al envejecimiento replicativo.

Reducción de
Sir2 e histonas
en telómeros
en H4K16Q

• K16Q reduce significativamente la duración de vida

• La abundancia de Sir2 no cambia en mutantes, la reducción de vida no es por pérdida

de Sir2

•La hiper-acetilación de H4K16 causa pérdida de histonas en telómeros

 H3K56ac
regulada por
Hst3 y Hst4
(integridad del
genoma y
replicación)

Acetiltransferasa de H3K56

Ambas sustituciones así como la deleción reducen la vida y causan

sensibilidad al daño del DNA porque la acetilación de K56 es
necesaria para la integridad del genoma, la acetilación de H4K16 y
H3K56 influencian longevidad pero vía diferentes mecanismos
 Acortamiento de vida por H4K16 es
epistatico con Sir2
La deleción del homologo SGS1 causa el acortamiento
de vida pero no afecta H4K16ac o niveles de histonas.

K16 funciona de la H4K16

H4K16 hipoacetilada
hipoacetilada
misma manera que es
es requerida
requerida para
para la
la
Sir2 (en sgs1Δ extensión
extensión de
de vida
vida por
por
sustituciones si la
la sobreexpresión de
sobreexpresión de
afectan) K16 y Sir 2 Sir2
Sir2
actúan de manera
dif. a Sgs1
 H4K16 funciona en una vía diferente a la
formación de ERC
Sir2 promueve la longevidad al nivel de rDNA inhibiendo la formación de ERCs, que se
acumulan en las células madre y causan senesencia.

Fob1 reduce ERCs.

Si K16Q reduce vida
por efectos
exclusivamente en
rDNA, entonces K16Q Entonces…
no acortará la vida en K16Q
fob1Δ influencia la
duración de
vida por un
mecanismo
diferente a
Fob1 y ERCs
Sir2 forma un complejo con Sir3 y Sir4 en telómeros y
el loci HM; y el complejo RENT en rDNA.

La extensión de vida
por sobreexpresión de
SIR2 se suprime por
deleción de SIR3

Deleción de SIR3 o
SIR4 acorta la vida
 Estos datos proporcionan un modelo en el que:
 El complejo Sir2/3/4 funciona modulando el
envejecimiento mediante mantenimiento de la cromatina
telomerica.

 H4K16 es un sustrato clave de Sir2 durante

envejecimiento.

 Las alteraciones de la cromatina en telómeros y otros loci

silenciados resultan del decrecimiento en la abundancia
de Sir2 durante el envejecimiento.
DISCUSIÓN
• La delecion de Sas2 establece los niveles de Sir2 en células replicativamente viejas y estos niveles
extienden su longevidad.
• Las mutaciones en H4K16 afectan negativamente el periodo de vida celular. Mutaciones rio abajo en
Sir2 provocan una ruta parcialmente distinta para la acumulación de ERC (rDNA extracromosomal
circularizado) en células viejas.
• Se demostró un decremento en la abundancia de la proteína Sir2 asociado con el envejecimiento
celular, esto acompañado por un incremento en la acetilación de histonas H4K16 y la perdida de
histonas en regiones subtelomericas especificas en células replicativamente viejas. Esto sugiere
un silenciamiento transcripcional en este loci.
• S. cerevisiae provee un modelo para el análisis de la cromatina durante el proceso de
envejecimiento celular. Se identifico un nuevo rol para la acetilación de H4K16 y el estado de la
cromatina telomerica en la determinación de la longevidad, esto mediado por acetilación con
Sas2 y desacetilación con Sir2.
Puntos establecidos.
• En efecto, aunque la evidencia extensa apoye la idea de que la vida replicativa está
regulada por Sir2 en función de ADNr, un mecanismo de Sir2 relacionados con el
envejecimiento distinto de ERC ha sido sugerido; ya que Sir2 también promueve
longevidad replicativa por lo menos en una vía adicional localizada en los telómeros. En
esta vía, Sir2 en células jóvenes mantiene baja acetilación H4K16 en los telómeros y
regiones subtelomericas y trabaja con SAS2 para establecer un límite de silenciamiento.

En las células viejas, debido a la pérdida de Sir2 y la acción de SAS2, H4K16ac

elevada conduce a la pérdida de las histonas en los elementos X de los
telómeros. El papel de Sir2 en la lucha contra H4K16ac específicamente en una
vía mediada por el envejecimiento de los telómeros es potencialmente
conservado evolutivamente, ya que los cambios teloméricos tienen un
importante papel en el envejecimiento y el cáncer y se correlacionan con las
alteraciones de la cromatina.
Hay siete sirtuinas en mamíferos, y tres desacetilan H4K16 (Sirt1,
SIRT2 y SIRT3). Es posible que la reducción de la actividad o el nivel
de estas sirtuinas promueve el envejecimiento celular mediante el
aumento de H4K16ac.
RESUMEN DE MÉTODOS
 Las células de levaduras madre
fueron aisladas de 2-4 rondas de
cultivo, las células fueron
marcadas con biotina, cultivadas
durante la noche, seguido de
purificación por afinidad.
La edad media de las células
aisladas se calcula contando el
brote de cicatrices determinadas
por el manchado con Calcofluor.
(microscopia directa).
Extractos de células completas
jóvenes y adultas se analizaron por
Western Blot con anticuerpos
específicos.
Una Reacción cruzada con
formaldehido en células jóvenes y
adultas fue usada para la
inmunoprecipitacion de la
cromatina (ChIP) con anticuerpos
específicos
Extracción de ADN y ARNm total
seguido de PCR en tiempo real se
utiliza para cuantificar el número
de copias de ADNr y niveles de
expresión de SIR2.
La especificidad de anticuerpos clave
(H4K16ac, H3K56ac, H3K9ac,
H3K4me3 y Sir2) utilizada en este
estudio se verificó mediante Western
Blot con extractos de células portadoras
de mutaciones puntuales en histonas o
deleción del gen de estas.
La Immunoprecipitacion ADN se
cuantificó por PCR en tiempo real,
con un juego de primers blanco de
las regiones específicas.
Una evaluación estadística de las
diferencias de esperanza de vida se
determinó mediante la prueba de
Wilcoxon de suma de rangos.
Cepas de levadura con mutaciones puntuales
en genes de histonas fueron generados por la
eliminación de las dos copias de casetes de
genes de histona H3 y H4 wildtype, y
completado por una copia mutante de H3 y H4
ya sea en un plásmido de levadura CEN-
controlados, o la integración de una copia
mutante a su ubicación del gen original.
 MÉTODOS
Plasmidos y lineas Celulares..
• Plásmidos pWD23, pWD25, pWD35, pWD36, pWD43 y pWD45con mutaciones puntuales en H4K16R,
H4K16Q, H3K9R, H3K9Q, H3K56R y H3K56Q, respectivamente, fueron generados por mutagénesis
dirigida QuikChange (Stratagene) del plásmido pRM204 que contiene una copia wild-type de genes para
las histonas H3 y H4,(genes HHT2-HHF2) y esto verificado por secuenciación.
• Las cepas que contienen el plásmido con el gen de la histona mutante como la única fuente para histona
H3 y H4 fueron hechas al trasladar el plásmido con el gen mutante en cepas FY1716 seguido por la
selección en un medio de cultivo con 1mg/ml de 5-FOA . Esto para remover células con el plásmido que
contiene el gen wild-type de la histona .

Obtención de levaduras madre.

• Las levaduras madre fueron obtenidas de cultivos en crecimiento exponencial en medio YPD
(1% extracto de levadura, 2% bactopeptona, 2% dextrosa) por medio de marcación en
superficie con NHS-LC-Biotina.

Preparación de extractos de levaduras completas y

realización del western blot.
• Extractos de células completas fueron preparados basados en un protocolo ya establecido. La detección de
proteínas fue realizada por SDS-PAGE y transferida a membranas PVDF. Los blots obtenidos se
determinaron por reaccion con anticuerpos específicos para histonas H3, H4. también se detecto Sir2.
Cuantificacion de numero de copias de rDNA y niveles de
expresion de mRNA.
• DNA total fue purificado a partir de 100μg de extracto de levaduras completas jovenes y adultas
utilizando un kit de purificacion QIAGEN PCR.

Inmunoprecipitacion de la cromatina..
• Muestras de levaduras fueron sometidas a reacción cruzada con 1% de formaldehido, esto a temperatura
ambiente durante 10 minutos, inmediatamente después la obtención de muestras. La inmunoprecipitacion
de la cromatina (ChIP) fue desarrollada con anticuerpos específicos y cuantificada por PCR- tiempo real.

Silenciamiento del Telomero

• Muestras de levaduras jóvenes y adultas fueron obtenidas como se describió previamente, excepto que la
escala se redujo 20 veces. Alrededor de 1X10^7 células fueron diluidas en 200 μl, seguido por una serie
de diluciones 10 x. después 10 μl de cada dilución fueron sembrados en medio sintético SC y SC con 1
mg/ml de5-FOA. Las células que se observaron fueron colonias resistentes que no producían el toxico,
esto debido al silenciamiento del gen reportero ubicado en los telomeros.

Determinación de Longevidad replicativa ..

• La longevidad replicativa de las levaduras fue determinada por medio de micromanipulacion y un estudio
estadistico de diferencias utilizando la prueba de rangos y suma Wilcoxon .

Tratamiento con Nicotinamida.

• Células de levadura fueron cultivadas a 30º C en YPD, durante la noche, despues transferidas a medio
YPD fresco que contenia 5 mM de nicotinamida, posteriormente se continuo su cultivo por 4-5 horas .