FUNDAMENTOS Y APLICACIONES DE

LAS SEPARACIONES ANALÍTICAS

UNIDAD IV
apaz de explicar los diferentes métodos (y técnicas) empleados
 MÉTODOS DE SEPARACIÓN.
Método. Fundamento.
Precipitación. Diferencias de solubilidad.
Destilación. Diferencias de volatilidad.
Sublimación. Diferencias de presiones de vapor.
Extracción. Diferencias de solubilidad entre dos fases inmiscibles.
Cristalización. Formación de redes cristalinas en un disolvente de
elección o en un par de solventes.
Flotación. Diferencia de densidad de una sustancia con respecto a
un líquido.
Ultrafiltración. Tamaño de las partículas vs diámetro del poro de la
membrana.
Diálisis. Osmosis, flujo de sustancias a través de la membrana.
Electrodepositación. Electrólisis con electrodos inertes.
 SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS.
Cromatografía de: Fundamento.
Adsorción en columna. Sobre un lecho estacionario sólido y con un
sólo disolvente líquido como fase móvil, la
muestra experimenta múltiples adsorciones y
desorciones.
Partición en columna. Distribución o reparto del soluto entre dos
líquidos inmiscibles de la columna.
Capa delgada. Adsorción o partición sobre una lámina fina,
generalmente de sílice o alúmina.
Papel. Partición sobre una lámina de celulosa (papel
filtro).
Intercambio iónico. Inmovilización temporal de cationes con
resinas ácidas, y retención de aniones con
resinas básicas.
 SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS -2.
C ro m atog rafía d e:F u n d am en to.
M a llas m o lecu la res.
L o s po ro s del ta m iz d esh id ratad o , así co m o la
fo rm a y d im e n sió n m o lecu lar, determ in a n la
d ifusió n a través d e la estructura crista lin a.
F iltra ció n en gel. A l p erm e ar la m ue stra a través d e u n g e l
apro p iado , se retie ne e n fo rm a se lectiva a la s
m o lécu la s en base a su tam a ño .
G a ses. E n la cro m ato g rafía d e gas – líqu id o , se
p ro d uce la p artic ió n de l so luto entre la fa se
g aseo sa m ó v il y la fase líq u ida estac io naria.
E n la cro m ato g rafía de gas – só lido e l pro ceso
es de ad so rció n.
HPLC. S eg ú n sea e l pro ceso qu e se em p le e, p ued en
estar im p lic ad o s: p artic ió n, interca m bio ió n ico ,
exc lu sió n en g e l o adso rció n.
 PROCESOS CROMATOGRÁFICOS.

P R O C E S O S C R O M A T O G R

C r o m a t o g r a f í a

F a s e e s t a c i o n a r ia F a s e e s t a c i o n a r i a
s ó l i d a l í q u i d a

A d s o r c i ó n P a r t i c ió n

F a s e m ó v Fi l a s e m ó v Fi l a s e m ó v Fi l a s e m ó v i l
lí q u i d a g a s e o s a l í q u i d a g a s e o s a

C r o m a t o g C r a r fo í am a t o g C r a r fo í am a t o g C r a r fo í am a t o g r a f í a
lí q u i d o - s ó g l ai d s o - s ó l li íd q o u i d o - l í q g u a i sd o - l í q u id o
 USOS DE LA CROMATOGRAFÍA.

A n alítica La cro m ato grafí

de gases o la de
en la identificac
m uestra. L as d
fro ntales de l
co m po nentes en
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

Reservorio Tapón
con eluyente
Muestra
Na2SO4 Nivel para ajustar
la verticalidad

Fase estacionaria Embudo para

añadir eluyente

Placa filtrante Espacio mínimo

  CONSIDERACIONES Y ACUERDOS EN LOS
PROCESOS CROMATOGRÁFICOS.


◆ En los métodos laminares, la aplicación de los estándares

y la muestra será puntual. Es imprescindible evitar la
difusión radial.
◆ Es necesario que las superficies sean homogéneas. Las
orillas deben ser rectas y paralelas.
◆ La señalización se efectúa con lápiz. Los trazos se harán
evitando dañar la superficie.
◆ Cuando una sustancia se pone en evidencia con luz de
254 nm, su contorno se marca con puntos. Si el
revelado se dio con radiación de 366 nm, se delimita la
región con trazos en forma de guiones.
CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL
ASCENDENTE Y DESCENDENTE.
 CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL.
Frente del disolvente

Punto de
Posición aplicación
inicial
Punto de
aplicación

Desarrollo con el primer Desarrollo con otro sistema de

sistema de elución elución después de rotar 90°
Cromatografía de capa fina monodimensional de Surf, DRM y
S (140 nmoles de Pls c/u) y estándar de Chol (0.5  g)
desarrollada con el eluyente hexano/éter etílico/ácido acético
(80:20:2 por volumen). a) punto de aplicación, d) colesterol.
 DRM S

Mezcla de estándares de lípidos

Surf

1a

2a

Figura 4. TLC bidimensional de las muestras DRM, S, y Surf que fueron

aplicadas en alícuotas conteniendo 120 nmoles. La identificación se llevó a
cabo comparando con las manchas reveladas en la mezcla de estándares;
a) LPC, b) SM, c) PC, d) PS + PI, e) PG, y f) PE. Los eluyentes utilizados
fueron: 1a. dirección Clf/MeOH/NH3(65:25:4 v/v), y 2a dirección Acetato de
metilo/n-proOH/Clf/MeOH/KCl 0.21% (25:25:25:10:9 v/v).
CROMATOGRAFÍA RADIAL.

Papel

Eluyente Pabilo capilar

Cromatograma Origen
 ELUYENTES PARA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

Separación. Solventes.
Aminoácidos. n butanol : ácido acético glacial : agua (120 : 30 : 50).
Fenol : agua : amoniaco 0.80 (160 : 40 : 1).
Azúcares. Acetato de etilo : piridina : agua (120 : 50 : 40).
Isopropanol : agua (160 : 40).
Ácidos orgánicos.n butanol : ácido acético glacial : agua (120 : 30 : 50).
Esteroides. Bencina : cloroformo (1 : 1).
purinas y n butanol : ácido acético glacial : agua (120 : 30 : 50).
pirimidinas. n butanol : amoniaco 0.88 : agua (172 : 10 : 18).
 ELUYENTES PARA CROMATOGRAFÍA
EN CAPA DELGADA.

S eparac ió n. S o lve ntes.

A m ino ác id o ns. bu ta no: lác ido acético: ag ua (60: 20 : 2 0).
n p ro p ano: lagu a (6:4 3 6 ).
A zú c ares. A cetato d e etilo : iso pro pano: ag
l ua (63: 2 4 : 1 2).
n p ro p ano: la m o n iaco: agu a (6: 2 : 1).
L íp id o s. É ter.
C lo ro fo rm:om etano:l ag ua (65: 2 5 : 4 ).
E stero ides. C lo ro fo rm:oaceto na (3 : 2 ).
E tano l a l 2 % en be nc ina.
NEBULIZADOR O ASPERSOR.
Keulemans ha definido la cromatografía como un
método físico de separación en el cual los componentes
a separar se distribuyen entre dos fases, una de las
cuales constituye la fase estacionaria, de gran área
superficial, y la otra es un fluido (fase móvil) que pasa a
través o a lo largo de la fase estacionaria.
qLa fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido
dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte, de
gran área superficial.

qLa fase móvil es un fluido (puede ser gas, líquido o

fluido supercrítico) que se usa como portador de la
mezcla
q
qEn la cromatografía ocurren dos fenómenos muy
importantes y que son prácticamente los rectores del
proceso de separación: la adsorción y la absorción.
qLa adsorción es la retención de una especie química
en los sitios activos de la superficie de un sólido,
quedando delimitado el fenómeno a la superficie que
separa las fases o superficie interfacial.
Esta retención superficial puede ser física o química. La
adsorción depende de la naturaleza de la sustancia
adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado
de subdivisión del adsorbente, y de la concentración.

qLa absorción es la retención de una especie química

por parte de una masa y depende de la tendencia que
tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente
con la misma.
qExisten muchas maneras de clasificar los métodos
cromatográficos. Según, Giddings, se puede clasificar la
Cromatografía por sus variantes:
SEGÚN
ØFase Móvil (puede ser gaseosa, líquida ó fluido supercrítico)
ØFase Estacionaria
ØMecanismo de Retención (tipos de equilibrios implicados en la
transferencia de los solutos entre las fases).
ØForma de Contacto entre las fases (columna ó superficie plana)
ØDimensionalidad
ØEscala Física
ØGradientes

Gas Chromatograph

Sujeewa S. Palayangoda

Group meeting - 03/01/2006

 CROMATÓGRAFO DE GASES.

Termostatos
Puerto
de
inyecció Columna
n

Detector
Controlador Horn
de flujo o Computadora Impresora

Gas
acarreador
 Basic components of Gas Chromatograph

•Gas Filters/Traps Data system

• H

•Flow control
•
•Injector
RESET

• Regulators Syringe/Sampler
•Oven, Column
• Inlets
•Detector
• Detectors
Argon

•Eluents
Hydrogen
Oxygen

• Column
•Recorder
  Cromatograma y su Interpretación


◆Line Base
◆Pico Cromatográfico
◆Base del Pico
◆Área del Pico
◆Altura del Pico
◆Ancho del Pico
◆Ancho del pico a la mitad de la altura
  TEMPERATURAS EN EL CROMATÓGRAFO


◆ Temperatura de la columna baja; se separan bien las

sustancias de p.e. bajo, pero no las de p.e. alto.
◆ Temperatura de la columna es alta; se separan bien
las sustancias de p.e. alto, pero no las fracciones
volátiles.
◆ La temperatura del inyector debe ser mayor que la de
la columna,
columna para producir la volatilización inmediata
de la muestra, después de su inyección. Es necesario
cuidar que no sea excesiva para evitar la
descomposición o la isomerización de sus
constituyentes.
◆ Λ a temperatura del detector debe estar por lo
menos, 10°Χ α ρ ρ ι β α δ ε λ α
τ ε µ π ε ρ α τ υ ρ α δ ε λ α
χ ο λ υ µ ν α , π αρ α ε ϖι τ α ρ λ α
χ ο ν δ ε ν σαχ ι ⌠ν δ ε λ ο σ
αν αλ ι τ ο σ
 Inyección de la muestra
La muestra se inyecta con un jeringa a través de un septo de
goma y se vaporiza. Generalmente 0.1 a 10 µ Λ .

Controlar la temperatura del horno de inyección.

Para columnas tubulares se tienen que manejar con puertos

de inyección más elaborados pues no pueden manejarse
muestras tan grande.

La inyección dividida: Sólo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a

2 µ Λ δ ε µ υ ε στ ρ α ι ν ψε χ τ αδ α
λ λ ε γ α α λ α χ ο λ υ µ ν α; ε λ ρ ε σ τ ο σε
ε λ ι µ ι ν α.
 INYECTORES PARA CROMATOGRAFÍA DE
GASES CON COLUMNAS EMPACADAS.
◆Estos vaporizadores simples conducen todo el flujo al
interior de la columna. Sin embargo, al retener a los
componentes no volátiles protegen a la columna.

◆El interior del inyector puede contener un pequeño

tubo de vidrio conocido como inserto (liner). En tal
caso la columna sólo llega a la parte inferior del
inyector.
 INTRODUCCIÓN DE LAS MUESTRAS.
◆En el análisis por cromatografía de gases son críticos los
pasos de: inyección con una microjeringa, evaporación
instantánea de las muestras líquidas en la cámara del
inyector, y el transporte a la columna.
◆Es necesario minimizar el ensanchamiento de la banda, en
el trayecto de la cámara del inyector a la columna, para
obtener picos con buena resolución.
◆La difusión hacia atrás debe ser eliminada, porque causa
bandas anchas y puede producir picos fantasmas.
◆Dada su gran eficiencia y pequeña capacidad de carga, la
selección y funcionamiento del sistema de inyección, es
muy importante en las columnas capilares.
 UTILIDAD DE LOS INSERTOS.

eficiente
Los insertos de vidrio se usan para lograr la transferencia
de la muestra inyectada, para homogeneizar a los
componentes volatilizados, y para retener a los no
volátiles.

como
En el análisis de sustancias de alto punto de ebullición
los esteroides, es necesario adicionar lana de
vidriodesactivada al inserto para aumentar su capacidad.
 INSERTOS PARA INYECTORES EN LA
CROMATOGRAFÍA DE GASES CAPILAR.

Inserto con cambiador de dirección para división.

Inserto con placa filtrante para división.

Inserto con capucha laminar para división.

Inserto para inyección sin división.

TÉCNICAS DE INYECCIÓN EN CROMATOGRAFÍA
CON COLUMNAS CAPILARES.
Purga del Purga del
septum septum
Gas Gas
acarreador acarreador

Inserto Inserto

Salida del
divisor
Columna Columna
CON DIVISOR SIN DIVISOR
TÉCNICAS DE INYECCIÓN EN CROMATOGRAFÍA
CON COLUMNAS CAPILARES

Gas
acarreador Inyector
Gas
acarreador
Inserto Muestra líquida
formando una
película.

Columna de Acumulo
calibre grande Columna líquido
DIRECTA EN COLUMNA
 INYECCIÓN CON DIVISOR (SPLIT).
Es usual inyectar de 0.5 a 2 µ l del espécimen líquido.
Una pequeña fracción de la muestra vaporizada entra a la
columna, en tanto que, la porción mayor es desalojada
como desecho (venteo). Esto permite obtener bandas de
entrada estrechas. El flujo desalojado es controlado por
una válvula de aguja. Los rangos típicos son:
◆ En las columnas capilares de 1:50 a 1:500
◆ Columnas de alta capacidad de muestra de 1:5 a
1:50
◆ Se puede exceder la relación 1:1000, en las
columnas
de ultra-alta resolución.
Ejemplo: el caudal de la columna es de 0.5 ml / min, y
el flujo a la salida de la válvula del divisor es de 160 ml /
min. La relación de división es 0.5 : 160 ó 1 : 320.
 INYECCIÓN SIN DIVISOR (SPLITLESS).

◆Estando la columna a baja temperatura, se cierra la válvula

del divisor antes de introducir la muestra. El incremento de
temperatura produce su volatilización en el inserto que está
en la cámara del inyector. Dado que se requieren entre 20 y
90 segundos, para que la fase móvil transfiera a los vapores
a la columna, las bandas iniciales son anchas, pero al pasar
a una zona de menor temperatura condensan al inicio del
tubo. Así se generan bandas estrechas y se logra mejorar el
rendimiento de la eficiencia.
◆Después que la mayoría de la muestra fue transferida a la
columna, se abre la válvula de aguja y se deja así hasta la
conclusión del análisis. El desalojo del vapor remanente,
puede causar disminución en el tamaño de las señales de
los componentes con alto punto de ebullición.
 INYECCIÓN SIN DIVISOR
◆El tiempo de espera para abrir la válvula depende del
solvente, de los puntos de ebullición de los analitos, y del
flujo y presión en la columna. Lo común es de 20 a 60 seg.
◆Al emplear inyección sin división se introducen cantidades
grandes de muestra en la columna, esto es bueno cuando
se quiere aumentar la sensibilidad al máximo. Para evitar
la saturación, en las columnas capilares convencionales se
debe evitar inyectar más de 50 ng.
◆Si los analitos tienen índices de retención mayores de 600,
es posible emplear esta técnica de inyección.
◆Si se quiere evaluar algún analito traza en una alícuota que
posee especies no volátiles, o cuando se procesan
muestras sucias está indicada inyección sin división.
 INYECCIÓN DIRECTA.
◆Se usa en la cromatografía con columnas abiertas con
diámetros de 0.53 a 0.75 mm.
◆De forma íntegra, los componentes volátiles de la
muestra son conducidos por la fase móvil a la columna.
◆Los inyectores de este tipo son considerados como la
transición entre los que se usan en la cromatografía con
columnas empacadas, y los diseñados para columnas
capilares (0.25 a 0.32 mm). En esencia, tienen los
mismas características y generan beneficios similares.
◆Los insertos que se emplean en estos inyectores son
diferentes a los utilizados en la cromatografía con
columnas empacadas.
•Injector
 DIVISOR ANULAR.

Salida del divisor (split).

De la cámara
de mezcla A la columna
capilar
 
Columna
◆ Es el lugar donde ocurre la separación. Se dice
que es el corazón de un cromatógrafo.

◆ Los materiales con los cuales generalmente se

pueden elaborar las columnas son: cobre,
aluminio, acero inoxidable, vidrio ó teflón.


◆Ε λ ρ ε λ λ ε ν ο π υ ε δ ε σε ρ υ ν
σ⌠λ ι δ ο , ⌠ υ ν λ  θ υ ι δ ο
ρ ε χ υ β ρ ι ε ν δ ο υ ν σ⌠λ ι δ ο .

 
Columna
◆ Empacadas


– Analítica
– Preparativas


◆ Capilares


– W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular)

– S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular)



  Factores que Afectan la Eficiencia de una Columna


– Longitud de la Columna
– Diámetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de diámetro
externo)
– Tamaño de las partículas del relleno
– Naturaleza de las fases
– Cantidad de fase estacionaria
– Temperatura de la columna
– Velocidad del gas portador
– Cantidad de muestra inyectada
– Material del cual está elaborada la columna
– Enrollado de la columna

 un buen soporte debe reunir las
siguientes características:


– Elevada Superficie por unidad de volumen

– Estabilidad Térmica
– Dureza mecánica suficiente para que pueda
resistir los procedimientos de
revestimientos y relleno
– Inactividad química o de adsorción
– Baja resistencia al paso de la fase móvil
•Column

Capillary column- 30m Packed column-3m

Cross-section of a column

La rapidez de la fase móvil en
una columna cromatográfica
suele expresarse como gasto en
volumen o como gasto lineal
EJEMPLO:
VOLUMEN DE COLUMNA; π r2 X longitud
Si se tiene los siguientes datos;
üθ = 0.60 cm
üla fase móvil ocupa el 20% de la columna
ü¿qué volumen ocupará la fase móvil por cm de
columna?
⇒π (0.30 cm)2 (1 cm) = 0.283 ml (total)
⇒El 20% será = 0.0565 ml que corresponde a la fase
móvil.
El gasto en volumen indica cuántos mililitros
de solvente por minuto recorren la columna. Un
gasto típico podría ser de 0.3 ml por minuto.

El gasto lineal indica cuantos centímetros de

longitud de columna recorre el solvente en un
minuto.

A PARTIR DEL RESULTADO DEL EJEMPLO

ANTERIOR
Dado que 1 cm de longitud de columna contiene
0.056 ml, 0.3 ml ocupará (0.3 ml/0.056 ml/cm) = 5.3 cm
de longitud de columna.
El gasto lineal que corresponde a 0.3
ml/min es 5.3 cm/min
u Caudal = Volumen de disolvente que pasa
por la columna por unidad de tiempo.
u El gasto en volumen = Indica cuántos
mililitros de solvente por minuto recorren
la columna. Un gasto típico podría ser de
0.3 ml por minuto.
u Velocidad lineal de flujo = Distancia
recorrida por el disolvente por unidad de
tiempo.
u El gasto lineal = indica cuantos
centímetros de longitud de columna
recorre el solvente en un minuto.
u
 Determination of Retention Time

Since Velocity = Distance

Time

Retention Time = Dist(cm)

Vel(cm/min)

Dist = Distance chart moves in cm

Vel = Velocity of chart in cm/min

Starting Point
On Chart

Distance
  INTERACCIONES EN LA COLUMNA.

Gas acarreador (Ac ), no es retenido en la columna.
1.5 m
Ac

15
. m
f = 0.75 m / min. t1 =
0.75 m / min .
= 2 min .

Ac

15
. m
f = 0.5 m / min. t2 = = 3 min .
0.5 m / min .
  INTERACCIONES EN LA COLUMNA - 2.

1.5 m
Gas a

f = ( 80 / 100) ( 0.5 m / min.) = 0.4 m / min.

1.5m
t3 = = 3.75 min .
0.4m / min .

Gas b Tiempo en la Gas a

60 % fase móvil. 80 %
Tiempo en la
40 % fase estacionaria 20 %
  INTERACCIONES EN LA COLUMNA - 3.

1.5 m
Gas b

f = ( 60 / 100) ( 0.5 m / min.) = 0.3 m / min.

15
. m
t4 = = 5 min.
Gases
0.3 m / min.

a, b, Ac
t (Ac ) = 3 min. tR (a) = 3.75 min. tR (b) = 5 min.
 Tiempo de retención

tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm

retención relativa = α = t’r2 /
t’r1
ESTUDIAR DE LA PÁGINA 619 A LA PAGINA 671 DEL LIBRO Análisis Químico
Cuantitativo, Daniel C. Harris. Edit. Iberoamerica. (1992).

ECUACIONES
 El tiempo de retención, tr, para cada componente es el
tiempo necesario después de la inyección de la mezcla en
la columna para que el componente alcance el detector.

,
Tiempo de retención ajustado (corregido)


tr tr tm
= −
Para cualesquiera 2 componentes 1 y 2, la retención relativa
α ε σ:
,

α= t r2
,
t r1
 El factor de retención o factor de capacidad (relación de
retención o relación de reparto)
reparto se simboliza k y a
menudo k`.
tr − tm
k=
tm
Cuanto mayor sea el tiempo que un componente es retenido en la
columna, mayor es k. Los k grandes favorecen una buena separación pero
incrementan el tiempo y ancho de banda

La definición de factor de retención es equivalente a;

tiempo que pasa el soluto en la fase estacionaria C sVs

k= =
tiempo que pasa el soluto en la fase movil CmVm

En donde Cs/Cm relación de concentraciones de soluto en las fases estacionaria y

móvil en equilibrio (K = coeficiente de reparto), Vs y Vm son los volúmenes de la
fase estacionaria y móvil.
Combinando ecuaciones es posible obtener las formulaciones siguientes:

tr − tm Vs
k= =K
tm Vm

El volumen de retención, Vr, es el volumen de fase móvil que se requiere para

eluir un soluto dado de la columna cromatográfica.

Vr = t r × F
En donde F es el gasto en volumen de la fase móvil. El Vr de un soluto
particular es constante en un amplio intervalo de gastos.
Con las ecuaciones obtiene:
tr − tm V
k=
tm
=K s
Vm Vr = t r × F k=
tr − tm
tm

 Vs 
t r = t m  K + 1
 Vm 
multiplicando ambos lados de la ecuación por F :
 Vs 

Vr = t r × F = t m × F  K + 1, pero la cantidad t m × F = Vm
 Vm 
Por lo tanto;
Vr = KVs + Vm
 Relación entre tiempo de retención y coeficiente
de reparto

◆ La ecuación de capacidad dada es equivalente a decir:

◆
◆
◆
◆ Si el soluto pasase todo su tiempo en la fase móvil y nada en la fase estacionaria,
se eluiría en un tiempo tm, por definición. Haciendo tr = tm, resulta k' = 0, porque
el soluto no está nada en la fase estacionaria. Supongamos que el soluto pasa
el mismo tiempo en la fase estacionaria que en la fase móvil. En ese caso, el
tiempo de retención sería tr = 2tm, y k' = (2tm ‑ tm)/tm = 1. Si el soluto pasa tres
veces más tiempo en la fase estacionaria que en la fase móvil, tr = 4tm y k'= (4tm
‑ tm)/tm = 3.
 ◆ Si el soluto pasa tres veces más tiempo en la fase estacionaria que en la
fase móvil, habrá tres veces más de moles de soluto en la fase
estacionaria que en la fase móvil en un momento dado. El cociente de
la ecuación equivalente a:

donde CS es la concentración del soluto en la fase estacionaria, VS es el

volumen de la fase estacionaria, Cm es la concentración del soluto en la fase
móvil y Vm es el volumen de la fase móvil. El cociente CS/Cm es el cociente de
concentraciones de soluto en las fases estacionaria y móvil. Si se trabaja con
suficiente lentitud para que se alcance el equilibrio, el cociente Cs/Cm, es el
coeficiente de reparto, K,. Por consiguiente, podemos transformar la ecuación a:
que relaciona el tiempo de retención con el coeficiente de
reparto y los volúmenes de las fases móvil y estacionaria.
Como , la retención relativa también se puede
expresar como

Fundamento físico de la cromatografía. Cuanto mayor es el

cociente de coeficientes de reparto entre la fase móvil y la fase
estacionaria, mayor es la separación entre los componentes de
una mezcla. Esto es, la retención relativa de dos solutos es
proporcional al cociente de sus coeficientes de reparto. Este es
el fundamento físico de la cromatografía.
 Parámetros de retención
◆ Se inyecta en un cromatógrafo de gases una mezcla de benceno,
tolueno y metano. El metano da un pico intenso a los 42 s (NO SE
RETIENE), mientras que el benceno se eluye a 251 s y el tolueno a
333 s. Hallar los tr` y los factores k de cada soluto. Asimismo,
hallar la α (retención relativa) de los dos solutos.
SOLUCIÓN
 Tiempo de retención y coeficiente
de reparto
◆ En el ejemplo anterior, el gas metano dio un pico intenso a 42 s, mientras que
el benceno precisó 251 s. La columna cromatográfica de tubo abierto tiene
un diámetro interior de 248 µ m , y está recubierta en su cara interior con
una capa de fase estacionaria de 1,0 µ m de espesor. Estimar el
coeficiente de reparto (K = CS /Cm) del benceno entre las fases estacionaria
y móvil, y calcular la fracción de tiempo que el benceno pasa en la fase
móvil.

π ρ 2.
λ ο ν γ ι τ υ
SOLUCIÓN;δ Necesitamos calcular los volúmenes relativos de las fases
móvil y estacionaria. La columna es un tubo abierto con un recubrimiento
de fase estacionaria en su pared interior.
Los volúmenes relativos de las fases son proporcionales a las áreas
relativas de las secciones trans-versales, porque cada fase se extiende
por todo el tubo. Por tanto, VS/Vm = (7,8 x 102, µ m2 )/(4,83 x 104 µ m2
) = 0,016 1. En el ejemplo anterior, se vio que el factor de capacidad del
benceno es
 resulta el coeficiente de reparto:

Para hallar la fracción de tiempo que pasa en la fase móvil

donde ts es el tiempo que pasa en la fase estacionaria. La fracción de

tiempo que pasa en la fase móvil es
 Teorías del proceso Cromatográfico

El proceso cromatográfico, aparentemente simple en

la práctica, es en realidad una compleja unión de
fenómenos; hidrodinámico, cinético, termodinámico,
química de superficie y difusión.

Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, Las

más estudiadas son: Teoría de los Platos Teóricos
(Martin y Synge), Teoría Cinética (Van Deemter,
Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer) y Teoría
Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).
 Teorías del proceso Cromatográfico

Según la Teoría de los Platos, una columna

cromatográfica está constituida por una serie de platos
(segmentos imaginarios) que contiene una fase
estacionaria.
Supone que:
ØEl volumen de fase estacionaria en cada plato es
constante
ØEl volumen de fase móvil es constante de plato a plato
ØEn cada plato las dos fases están en equilibrio
ØEl valor del Coeficiente de distribución es constante e
independiente de la concentración del soluto.
Si la longitud total de la columna es L, la altura equivalente
de plato teórico (A.E.P.T o bién H.E.P.T.) es;

L
A.E.P.T =
N
La principal desventaja de la Teoría de los Platos
Teóricos es la falta de conexión entre;
vLa eficiencia de la columna cromatográfica, tamaño
de la partícula, la difusión, la velocidad de flujo y la
temperatura.
vLa otra desventaja es que utiliza un modelo basado
en muchas suposiciones.
En cromatografía no existen "platos"
físicos, de manera que se debe
considerar la altura de plato como un
término que relaciona la anchura de
una banda con la distancia que ha
recorrido a través de la columna.
Cuanto más pequeña es la altura de
plato, más estrecha es la banda.
 Difusión
◆
◆ Una banda de soluto se ensancha a
medida que pasa por una columna
cromatográfica. Teóricamente, una
banda infinitamente estrecha en la
entrada de la columna sale de ella en
forma de una gaussiana.
 2
 tr 
N = 16 
w
2
 
 tr 
N = 5.55
 w 1 
 2
En estas ecuaciones se
puede utilizar el volumen
de retención en lugar de tr

Cromatograma ideal
◆ En circunstancias menos ideales, la banda se hace
asimétrica.
Para estimar el número N se
traza una línea horizontal que
cruce la banda a una altura igual
a un décimo de la altura máxima.
Con esto se podrán medir las
regiones A y B. De esto resulta
una relación aproximada entre N
y estos parámetros:
2
 tr 
41.7 
 w0.1 
N=
A 
 + 1.25 
B 
Todas las cantidades
deben medirse con las
mismas unidades, minutos
o centímetros de papel
◆ Medida de platos
 Un soluto con un tiempo de retención de
407s tiene una anchura en la base de 13 s en
una columna de 12,2 m de longitud. Hallar el
número de platos y la altura de plato.


SOLUCIÓN

◆ La AEPT,
AEPT HETP o simplemente H, es la constante
de proporcionalidad entre la varianza (σ2) de la
banda y la distancia que ha recorrido (x). El
nombre está tomado de la teoría de destilación,
en la que la separación se. En cromatografía no
existen "platos" físicos, de manera que se debe
considerar la H como un término que relaciona la
anchura de una banda con la distancia que ha
recorrido a través de la columna. Cuanto más
pequeña es la altura de plato, más estrecha es la
banda.


◆ Pequeña altura de plato ocasiona picos estrechos y

esto ocasiona mejores separaciones.
◆ La capacidad de una columna para separar
componentes de una mezcla mejora al
disminuir la H. Decimos que una columna
eficaz tiene más platos teóricos que una
columna ineficaz. Los distintos solutos que
pasan a través de una misma columna tienen
diferentes H, porque tienen diferentes
coeficientes de difusión. Las H en
cromatografía de gases valen entre 0,1 y 1
mm,
mm en cromatografía de líquidos de alta
eficacia (HPLC)
HPLC valen aproximadamente 10
µ m, y en electroforesis capilar, menos de 1
µ m.
IDENTIFICACIÓN DE COMPONENTES EN LA MUESTRA.
 tm Tiempo muerto (no retenido).
t R 1 y tR 2 Tiempos de retención sin corregir.
tR1 ’ y tR2 ’ Tiempos de retención corregidos.
w Ancho del pico en la base (4 σ ).
wh / 2 Ancho a la mitad de la altura (2 σ ).
tR 2
tR 2 ’
tR 1
tR 1 ’
s oi tl ovili M

wh / 2
tm
oi ci nI

Minutos w
La Teoría Cinética considera el proceso
cromatográfico en función de los factores
cinéticos que intervienen en él;

vLas trayectorias múltiples (diferentes rutas) que

toma un soluto durante su movimiento (migración) a través del
empaque de la columna, provocando variaciones en la
velocidad del flujo.

vDifusión Axial o Longitudinal del soluto en la fase

móvil.

vResistencia a la transferencia de masa entre

las fases móvil y estacionaria.
La forma resultante de las bandas
depende de la velocidad de elución, de la
difusión del soluto a lo largo de la columna
y de la existencia de diferentes caminos
que las diversas moléculas de soluto
pueden seguir cuando se mueven entre
partículas de la fase estacionaria.
Todos estos efectos dependen de la
velocidad,  , de la fase movil.
  Ecuación de Van Deemter.
HETP = A + B / ν + C .ν
◆ A es el efecto de los multicanales en las columnas
empacadas. Analiza el efecto del tamaño y la forma
de las partículas, así como, la densidad del
empacado.


◆ B describe la dependencia de la difusión axial con la

movilidad de las moléculas en las fases.


◆ C representa la resistencia a la transferencia de masas.

A partir de este término se puede concluir que para
lograr sistemas eficientes es necesario que: Las fases
móviles sean poco viscosas como H2 o He, las fases
estacionarias fluidas en lugar de gomas, los
espesores de las películas delgados (décimas de
µ µ ) ψ λ ασ χ ο λ υ µ ν ασ
χ απ ι λ αρ ε σ ε ν λ υ γ αρ δ ε
µ ε γ αβ ο ρ ο ο ε µ π αχ αδ ασ.
◆ ν ϖε λ ο χ ι δ α δ χ ο ν θ υ ε λ α φ α σ ε
µ ⌠ϖι λ ατ ρ αϖι ε σ α λ α
 Gráfica de Van Deemter.

Flujo óptimo.
PT E H

B B difusión molecular.

C Resistencia a la transferencia de masa.

A Difusión de Eddy (multicanales).

Velocidad lineal de flujo.

Teoría Cinética de la
Cromatografía (2)

Existe una velocidad

óptima para la operación
de cualquier columna, a
la cual la altura de plato
alcanza su valor mínimo
  Fase Estacionaria Líquida



Al hablar de fase estacionaria líquida entramos en
contacto con dos palabras ó términos: Polaridad y
Selectividad.


◆ la polaridad se refiere a las interacciones

intermoleculares que involucra dipolos
permanentes.
◆
◆ Selectividad es definida como las diferentes
atracciones intermoleculares

  Cualidades de un líquido como fase
estacionaria:


q Viscosidad
q Tensión Superficial
q Tensión de Vapor
q Selectividad respecto a los componentes
de la fase móvil
q Reversibilidad del Reparto
q Estabilidad Térmica

  Gas Portador


q El gas portador cumple básicamente

dos propósitos: Transportar los
componentes de la muestra, y crear
una matriz adecuada para el detector.


◆ Inerte
◆ Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa
◆ Fácilmente disponible y puro
◆ Económico
◆ Adecuado al detector a utilizar

  Detectores


q Funcionan comparando una propiedad física entre el

gas portador puro y el mismo gas portador
llevando cada uno de los componentes que
previamente se han separado en la columna,
acción que se traduce en una señal tipo eléctrica,
que posteriormente se amplificará mediante un
registrador gráfico ó integrador permitiendo indicar
el momento que salen de la columna los
componentes.
  Detectores


◆ Detectores según su Grado de Selectividad :



– Universales.
Universales Responde a la mayoría de los
solutos que pasan por él.
–
– Selectivos ó Específicos. Exhibe una gran
respuesta a un grupo particular de
substancias con un mínimo de respuesta
a otras.

  Detectores


Destructivos y No destructivos


Detectores según su Modo de Respuesta:

Respuesta


– Dependientes del Flujo Másico.

Másico Producen una
señal que es proporcional a la cantidad de soluto
que pasa a través de él en la unidad de tiempo
pero es independiente del volumen de gas
portador requerido para la elución.
–
– Dependiente de la Concentración.
Concentración Dan una señal
proporcional a la cantidad de soluto por unidad
de volumen de gas portador que pasa a través
de él.
•
  Características de los Detectores


Sensibilidad.
Sensibilidad Medida de la efectividad de un detector
para convertir la muestra en una señal eléctrica
medible.


Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra

sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad
constante sin una desviación arbitraria. El significado
práctico de la linealidad del detector es el que le indica
al analista la concentración para la cual el detector es
confiable. Hay dos límites en la curva de linealidad:


El límite de concentración inferior, que es dado por el límite

de detección y,

El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación

arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma
un 5% de desviación.

  Características de los Detectores


Rango Dinámico Lineal.

Lineal Rango sobre el cual la sensibilidad
del detector es constante.
Ruido.
Ruido Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-
pico de la señal. El significado de conocer el nivel de ruido
de un detector es un factor determinante en la
determinación de la cantidad mínima detectable y el límite
inferior del rango lineal.
El Límite de Detección.
Detección Está definido como la mínima
cantidad de sustancia que puede producir una señal que
sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo.
Fondo Señal constante de salida generada por
el proceso en el que un detector está operativo sin que
alguna sustancia pase a través de él. Esta señal es muy
importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal
funcionamiento del detector.


 Detectores más usados en Cromatografía
de Gases


Conductividad Térmica (DCT O TCD) . Mide la

conductividad térmica del gas portador,
ocasionada por la presencia de substancias
eluídas. Variación de conductividad térmica del gas
de arrastre.
Ionización a la Llama. Basado en la medida de las
variaciones de la corriente de ionización en una
llama oxígeno-hidrógeno debido a la presencia de
substancias eluídas.
Captura Electrónica. Basado en la electronegatividad
de las substancias eluídas, y su habilidad para
formar iones negativos por captura de electrones.


 Detectores más usados en Cromatografía
de Gases


Fotometría a la Llama. Basada en la medida de la

intensidad de la emisión molecular de la
fluorescencia de heteroátomos en las moléculas
orgánicas.


Ionización de Llama Alcalina



Espectrometría de Masas

 CARACTERÍSTICAS Y PARÁMETROS
DE LOS DETECTORES.

Detector Principio de Selectividad Sensibilidad Estabilidad Temp. Gas

operación límite acarreador
TCD Conductividad Respuesta 6 x 10 -10 Buena 450 °C He, H 2, N 2
térmica de gases universal
FID Llama de Compuestos 9 x 10 -13 Excelente 400 °
C He, H 2, N 2
H2 y O 2 orgánicos
ECD N2 β → e- Compuestos 5 x 10 -14 Perfecta 350 °
C N2 o Ar
e - + muestra halogenados con 10 %
→ diminución y carbonilos de CH 4
de la señal

TCD Detector de conductividad térmica. FID Detector de ionización de llama.

ECD Detector de captura de electrones. Temp. Temperatura
63
La partícula βpuede ser suministrada por el Ni o el tritio que contiene el detector.
 INTERVALOS LINEALES DE LOS DETECTORES.
TED
PID
FID
ECD
TCD

FPD

0.001 1 1000

TED Detector de emisión termoiónica. PID Detector de fotoionización.

FID Detector de ionización de llama. ECD Detector de captura de electrones.
FPD Detector fotométrico de llama. TCD Detector de conductividad térmica.
 DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA

Colector
Encendedor
Llama

Gas acarreador Aire

Hidrógeno
 ELEMENTOS Y MOLÉCULAS QUE DAN POCA
O NINGUNA SEÑAL EN EL FID.

E lem ento s y m o léculas que d an po ca o ninguna señal.

He C S2 N H3
Ar COS CO
Kr H 2S C O2
Ne S O2 H 2O
Xe NO S iC l4
O2 N 2O S iH C 3l
N2 N O2 S iF4
 
DETECTOR DE MASAS.


◆ Al emplear la cromatografía de gases - masas (CG/MS),

la identificación de los componentes de la muestra se
hace de forma inequívoca.


◆ Cualquier proceso cromatográfico único que no implique

alguna comparación espectral, es presuntiva de
identidad.


◆ En la CG/MS cualitativa se puede trabajar sin estándares.

Para ello, los espectros de los analitos que eluyen de la
columna cromatográfica, se comparan con los
espectros de la biblioteca del equipo. Otra opción es
interpretar los patrones de fragmentación del espectro
de masas.
  REQUISITOS DE LOS DETECTORES EN LA
CROMATOGRAFÍA CAPILAR.


◆ Alta sensibilidad, para poder detectar a los componentes

en las pequeñas porciones de muestra que pasan por
la columna.


◆ Respuesta rápida, para evidenciar los delgados picos.



◆ Poseer un sistema que incremente la velocidad lineal de

flujo justo antes que los componentes ingresen al
detector. Con el gas denominado makeup (maquillaje)
se disminuye el tiempo de residencia de las especies
en el detector y se minimizan las bandas anchas.
DISMINUCIÓN DEL TIEMPO DE RESIDENCIA DE LOS
COMPONENTES DE LA MUESTRA EN EL DETECTOR.

H2 y gas makeup

Flujo de
la columna Al detector
 FACTOR DE RESPUESTA DE UN COMPONENTE
EN UN DETECTOR ESPECÍFICO.
◆Diversos analitos producen diferentes magnitudes de
respuestas en el mismo detector.
◆El mismo compuesto genera respuestas distintas en
detectores que operan con otros principios.
◆En general, el área de un analito en un cromatograma
no es proporcional a la composición porcentual.
◆Esto genera la necesidad de determinar el factor de
respuesta para el componente con el detector usado.
◆Con el factor puede determinarse el porciento del
componente en la muestra.
 CALCÚLO DEL FACTOR DE RESPUESTA CON
EL DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA.

P ico P eso in y ec ta dÁore a (A ) A /W F a c to r

(W ) e nµ g e n c m2
a* 0 .4 3 5 4 .0 9 .1 9 1 .0 0
b 0 .6 5 3 6 .5 9 .9 5 1 .0 8
c 0 .8 6 4 7 .6 8 .7 9 0 .9 6
d 0 .8 6 4 8 .1 9 .3 8 1 .0 2
e 1 .7 6 0 1 5 .0 8 .5 2 0 .9 3

a * e s e l m a r c o d e r e fe r e n c ia

a* es el marco de referencia
 CÁLCULO DEL PESO DE UN COMPONENTE
EN UNA MUESTRA CON EL FACTOR .


◆ Con iguales condiciones y el mismo detector se puede

calcular el % en peso de (b,c,d y e) con relación al
marco de referencia a*.


◆ Por ejemplo, en una muestra desconocida, el componente

(b) se determina como sigue:

Wa · Ab
Wb =
Fb · Aa
CALIBRACIÓN ABSOLUTA.
 CALIBRACIÓN RELATIVA.

r adnát s el ed aer Á
nop mocl ed aer Á

Peso del componente

Peso del estándar
  MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO.


◆ El uso de un estándar inmerso dentro de cada muestra,

evita las incertidumbres inherentes a las inyecciones.
◆ Con este método se puede llevar la precisión a valores
próximos al 1 % de coeficiente de variación.
◆ Es necesario que el pico del estándar interno, esté bien
separado de los demás componentes de la muestra.
◆ Debe escogerse una sustancia que no esté presente en
la muestra. Por ejemplo, un buen estándar interno
para el estudio de aminoácidos es la norleucina
◆ El tiempo de retención del estándar debe estar próximo
a los de los analitos. Es ideal que esté situado a la
mitad del cromatograma.
 RESUMEN DE ECUACIONES DE LA
CROMATOGRAFÍA.
2
◆Número de platos teóricos.  tR 
N = 16  
◆Altura
 w
equivalente de plato teórico.
l
◆Delta de dos tR adyacentes. H = HETP =
N
◆Resolución ∆ tR
entre dos picos adyacentes. = t R 2 − t R1
◆Velocidad lineal de flujo. ∆ tR
R=
w1 + w2
l 2
µ=
tm
 ECUACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA - 2.
◆Factor de capacidad. tR ' t 
k'= k ' =  R  − 1
◆Eficiencia
tm  tm 
del solvente.
t R2 '
α=
◆Factor de separación. t R1 '
t R2
◆Platos requeridos. SF =
t R1 2 2
2  α   k '+1 
◆Longitud
N = 16( R )
de columna requerida.
   
 α −1   k ' 
Re q

 N Re q 
lRe q = lOrig  
 N Orig 
◆ Eficiencia de la columna.- Cada plato teórico (N)
supone un equilibrio teórico de distribución entre las
fases móvil y estacionaria. El número de total de
Nrepresenta el poder de separación de la columna y
la capacidad de la misma para producir picos
delgados. Al crecer N, disminuye W.


◆ Factor de Capacidad (k’).- Describe las velocidades de

migración de los analitos en la columna. En la
cromatografía de partición, la cantidad de fase
estacionaria es directamente proporcional a k’. En la
cromatografía de adsorción la proporcionalidad va
ligada a la superficie del adsorbente. En la HPLC de
intercambio iónico, la correspondencia es con el
número especies ionizadas.
◆ Selectividad (α ).-Expresa la retención relativa entre los
máximos de dos picos adyacentes. Al determinarse los
tiempos que permanecen anclados los dos componentes
en la fase estacionaria, se evalúan las magnitudes de las
interacciones y se establece la relación de separación.
α es conocida como eficiencia de la fase estacionaria.
La fase estacionaria es más selectiva mientras mayor es
α.


◆ Resolución (R).- Evalúa cuantitativamente el grado de

separación de dos especies que emergen adyacentes en
una columna. El valor mínimo aceptable de R en mezclas
sencillas es 1, (resolución aproximada al 98 %). En tanto
que, un valor de 1.5 produce una resolución de 99.7 %.
◆ Velocidad lineal (µ ).- al incrementarse
el diámetro de la columna se
incrementará el tiempo de análisis, al
menos que se igualen las velocidades
de flujo proporcionalmente. Para
comparar columnas con θ
δ ι φ ε ρ ε ν τ ε ε σ
ν ε χ ε σ αρ ι ο
ο π ε ρ αρ λ ασ α λ α
µ ι σ µ α µ ψ µ ι σµ α
δ ε ν σι δ αδ δ ε
ε µ π αθ υ ε .
 APLICACIÓN DE LAS ECUACIONES.
l= 3 m tm= 1 min. tR1 = 14 min. tR2 = 17 min.
w2= 1 min. R > 1.5 ¿Cuál es la longitud mínima
requerida para obtener una resolución de 1.5?

 17 
2
17 − 1 17 − 1
N = 16   = 4624 k'= = 16 α= = 1231
.
 1 1 14 − 1
2 2
 1231
.   16 + 1
= 16 ( 15
.) 
2
N Re q    = 1155 platos.
 1231
. − 1  16 
 1155 
lRe q = 300  = 75 cm.
 4624 
 ECUACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA - 3.
2
l ∆ tR
 tR  H= R=
N = 16   w1 + w2
 w N
2
l
∆ t R = t R 2 − t R1 µ= k'=
tR '
tm tm
 tR  t R2 ' t R2
k ' =   − 1 α= α ≠ SF =
 tm  t R1 ' t R1

2
 α   k '+1 
2  N Re q 
= 16( R )  = lOrig  
2
N Re q    lRe q
 α −1   k '   N Orig 
 CONCLUSIONES DE LA ECUACIÓN MAESTRA
 DE LA RESOLUCIÓN.

N  k'  α - 1 
R=

  
4  1 + k'  α 

2 4 6 8

k’
 Para tener buenas separaciones, se necesita que k’ sea
mayor de 2. Sin embargo, un valor mayor de 6, sólo
aumenta el tiempo del análisis sin mejorar la resolución.
CONCLUSIONES DE LA ECUACIÓN MAESTRA
DE LA RESOLUCIÓN
◆ Al graficar R vs α , σ ε ο β τ ι ε ν ε ο τ ρ α
γ ρ 〈φ ι χ α ασι ν τ ⌠τ ι χ α π ο ρ
α ρ ρ ι β α δ ε 6. ∆ ε β ι δ ο α θ υ ε λ ο
µ 〈σ υ σ υ α λ ε σ τ ρ α β α ϕ α ρ ε ν λ α
ζ ο ν α χ ε ρ χ αν α α α = 1, λ α
ρ ε σο λ υ χ ι ⌠ν µ ε ϕο ρ α
ν ο τ α β λ ε µ ε ν τ ε cuando se incrementa δ ε
1 α 6 ε λ ϖαλ ο ρ δ ε α .


 H o HETP es el segmento de columna que representa un

plato teórico, y usualmente se expresa en mm. Mientras
menor es H, mejor es la eficiencia del sistema.


◆ Ε σ ν ε χ ε σαρ ι ο χ αµ β ι αρ ε ν
ϖα ρ ι ο σ ο ρ δ ε ν ε σ δ ε µ αγ ν ι τ υ δ
ε λ ϖαλ ο ρ δ ε N π αρ α τ ε ν ε ρ υ ν α
β υ ε ν α ρ ε σο λ υ χ ι ⌠ν . Σ ⌠λ ο σε
δ ε β ε µ ε ϕ ο ρ α ρ Nχ ο ν σ ι σ τ ε µ α σ
EFICIENCIA DE LAS COLUMNAS Y SOLVENTES.

d1 d3
Normal

d2
Mayor selectividad o eficiencia
del solvente (α ). Los picos se
separan más y adelgazan.

Mayor eficiencia de la columna (más N).

Se obtienen picos delgados y altos.
 SELECTIVIDAD Y EFICIENCIA.

Selectividad (α ) α δ ε χ υ α δ α .
Eficiencia (N) mejorada.

Eficiencia (N) mejorada.

Selectividad (α ) adecuada. Selectividad (α ) baja.
Eficiencia (N) aceptable.
SEPARACIONES A TRES VALORES DE RESOLUCIÓN.
R = 0.75 R = 1.0 = 98 %

R = 1.5 = 99.7 %
 Platos necesarios para una resolución
dada

Dos solutos tienen una retención relativa α = 1,08 y tienen

los factores de capacidad k’1 = 5,0 y k’2 = 5,4. El número
de platos teóricos es prácticamente el mismo para ambos
compuestos. ¿Cuántos platos se necesitan para tener una
resolución de 1,5? ¿Y para una resolución de 3,0? Si . la
altura de plato es 0,20 mm, ¿qué longitud debe tener la
columna para una resolución de 1,5?

SOLUCIÓN
 N  k'  α - 1 
R=   
4  1 + k'  α 

 Para una resolución de 1,5. la longitud de

columna que se necesitaría sería (0.20
mm/plato)(8,65 x 103 platos) = 1,73 m.
LA TEMPERATURA MODIFICA tR , w y h.
Manteniendo constante el % de fase estacionaria (por
ejemplo 1%)

50oC

100oC
80oC
EL % DE FASE ESTACIONARIA MODIFICA tR , w y h.
Temperatura 80oC.

10 %

1%
5%
 Logaritmo del tR vs número de carbonos en
series homólogas en cromatografía isoterma.
Índice de Kovats en la cromatografía isoterma.
◆Es una medida de la retención relativa del analito en la
columna. Se emplean n alcanos como estándares de
referencia y condiciones controladas. Dado que este
índice sólo depende de la fase estacionaria y de la
temperatura, es apropiado para comparar los resultados
obtenidos en dos laboratorios.

◆Los índices de los demás componentes se calculan con:

log t R ' X − log t R ' N1

I X = 100n + 100 N1
◆Por definición log t R ' N 2 − log t R ' N1
t R ' N1 < t R ' X < t R ' N 2
 Cálculo del índice de Kovats.

◆El índice de Kovats por definición es I = 100 (N), por lo

tanto,el del hexano es 600 y el del heptano es 700.
tR’N1 = n hexano = 61 seg. = log 61 = 1.78533
tR’ X = 2 - butanona = 114.5 seg. = log 114.5 = 2.05881
tR’N2 = n heptano = 137 seg. = log 137 = 2.13672
N1 = 6 N2 = 7 n = N2 - N1 = 7 - 6 = 1

2.05881 − 1.78533
I X = 100 (1) + 100 ( 6 ) = 678
2.13672 − 1.78533
  UTILIDAD DEL ÍNDICE DE RETENCIÓN.


◆ En el caso anterior la 2 - butanona eluye entre el hexano

y el heptano, con la fase estacionaria empleada. Pero
si se usa otra fase estacionaria, su elución será entre
otros dos hidrocarburos.


◆ En 1984 Sadtler Research Laboratories introdujeron una

base de datos, con los índices de retención obtenidos
en cuatro tipos de columnas capilares de sílice. El
formato computarizado de dicha biblioteca permite la
búsqueda rápida del índice de retención, así de una
forma fácil se puede acceder a la posible identidad del
analito.
 CROMATOGRAMAS.
2
4
3

Isotérmico a 180°C.
1
5

3 5
Con programación
de temperatura de
1 50 a 250°C e
incrementos de
8°C por min.
 Desventajas de la cromatografía isoterma.

◆La cromatografía isoterma no permite una adecuada

separación, cuando los componentes tienen puntos de
ebullición muy distintos.
◆A baja temperatura se separan bien las sustancias de
p.e. bajo, pero no las de p.e. alto, que permanecen en
la fase estacionaria.
◆Por el contrario, a alta temperatura los especímenes de
mayor p.e. emergen separados, pero las fracciones
más volátiles pasan con demasiada rapidez, sin ser
diferenciados.
◆La ebullición hace que los componentes estén la mayor
parte del tiempo en fase de vapor. A temperatura muy
baja las muestras se difunden, disminuyendo N .
 
Cromatografía con temperatura programada.


◆ La temperatura de la columna deberá ser suficientemente

alta para que la presión de vapor de cada componente
sea razonablemente elevada, pero sin llegar a hervir.
◆ En el programa pueden incluirse una o más rampas de
temperatura y periodos isotérmicos al inicio en medio
y/o al final.
◆ Si se emplea programación de temperatura lineal, los tR de
las series homólogas crecen linealmente con el número
de carbonos, no logarítmicamente como en la isoterma.
◆ En el análisis de muestras que contienen componentes
con un amplio rango de puntos de ebullición, la mejor
opción es la cromatografía con programa de
temperatura.
 tR vs número de carbonos en series homólogas en
la cromatografía con programación de temperatura.
 Índice de Van den Dool y Kratz en la
cromatografía con temperatura programada.
◆Es una medida de la retención relativa del analito en la
columna. Se emplean n alcanos como estándares y
condiciones controladas. Se requiere especificar de
forma exacta las dimensiones de la columna, el perfil de
temperatura y el tipo de gas acarreador con su flujo. El
cálculo se realiza con:

t R X − t R N1
I X = 100n + 100 N1
◆Por definición t R N 2 − t R N1
t R N1 < t R X < t R N 2
 Cálculo del índice de retención en la
cromatografía con temperatura programada.

◆El índice por definición es I = 100 (N), por lo tanto, el del

triacontano es 3000 y el del hexatriacontano es 3600.

tRN1 = n triacontano (C30 H62 ) = 4.71 min.

tR X = colesterol = 5.53 min.
tRN2 = n hexatriacontano (C36 H74 ) = 8.81 min.
N1 = 30 N2 = 36 n = N2 - N1 = 36 - 30 = 6
5.53 − 4.71
I X = 100( 6 ) + 100( 30 ) = 3120
8.81 − 4.71
 CLASIFICACIÓN DE COMPUESTOS.
Clase I.- Agua, glicoles, glicerol, ácidos, polifenoles,
muy polar aminoalcoholes.
Clase II.- Alcoholes, ácidos grasos, fenoles, oximas, HCN,
polar aminas primarias y secundarias, NH3, HF, N2 H4,
nitrilos y nitrocompuestos con H en α .
Clase III.- Éteres, cetonas, aldehídos, ésteres, aminas
intermedio terciarias, nitrilos y nitrocompuestos sin H en α .
Clase IV.- Aromáticos, olefinas, CHCl 3 , CH2Cl2…etc.
poco polar

Clase V.- Alcanos,sulfuros, CS2, mercaptanos, CCl4

no polar
NÚMERO DE SEPARACIÓN O TRENNZAHL (TZ).
◆En la cromatografía capilar es posible evaluar la eficiencia
de la columna es a través de TZ, que se define como la
resolución existente entre dos miembros consecutivos de
una serie que difieren en un CH2 (homólogos).
◆Una ventaja de TZ sobre otras medidas de eficiencia, es
que puede aplicarse a las separaciones con temperatura
programada.
 R   100 
TZ = 
TZ =   −1  −1
 1.177   ∆I 
Donde: R es la resolución entre un par de homólogos.
ε σ λ α δ ι φ ε ρ ε ν χ ι α ε ν
λ ο σ  ν δ ι χ ε σ δ ε ρ ε τ ε ν χ ι ⌠ν
∆I δ ε Κ ο ϖα τ σ ο δ ε ς α ν δ ε ν
∆ ο ο λ ψ Κρ α τ ζ .
 CÁLCULO Y UTILIDAD DE TRENNZAHL.
◆Los n alcanos C12 y C13 tienen una resolución de 25.9, en
una columna capilar. Los mismos compuestos generan
una resolución de 8.1, en una columna empacada.
¿Cuáles son sus respectivos valores de TZ? ¿Cuantos
picos puede separar cada una de las columnas?

 25.9   8.1 
TZ =   − 1 = 21 TZ =   − 1 = 5.9
◆La columna 1capilar  1.21
.177  es capaz de resolver 
177picos entre C12
y C13 . En tanto que, la columna empacada sólo podrá
separar menos de 6 picos.
 VALOR MÍNIMO DE TRENNZAHL
REQUERIDO EN UNA SEPARACIÓN.
◆¿Cuál es el mínimo valor de TZ para separar dos
sustancias no homólogas cuyos índices de retención
de Kovats son 1270 y 1274?

 100 
=  la columna −en
TZ que
◆Es imprescindible 1 =las
24 condiciones
 1274 −al
de operación, proporcione
1270 
menos un Trennzahl de
24, para lograr separar a los dos compuestos
anteriores.
Ecuación de Golay para columnas capilares.
HETP = B / µ + C •µ
◆Α δ ι φ ε ρ ε ν χ ι α δ ε ς αν
∆ε ε µ τ ε ρ , ε στ α ε χ υ αχ ι ⌠ν ε σ
ε ξ αχ τ α ψ συ δ ε δ υ χ χ ι ⌠ν
τ ε ⌠ρ ι χ α ηα σι δ ο
χ ο µ π ρ ο β αδ α.
◆Π ο ρ ν ο τ ε ν ε ρ µ υ λ τ ι χ α ν α λ ε σ ,
ε στ ασ χ ο λ υ µ ν ασ σο ν µ 〈σ
ε φ ι χ ι ε ν τ ε σ.
◆Α λ ν ο π ρ ε σε ν τ αρ
ρ ε στ ρ ι χ χ ι ο ν ε σ σ ε ρ ι ασ δ ε
φ λ υ ϕο , ε στ ασ χ ο λ υ µ ν ασ
π υ ε δ ε ν σε ρ β αστ αν τ ε
λ α ρ γ α σ , τ  π ι χ α µ ε ν τ ε δ ε 10 α
60 µ ε τ ρ ο σ . Χ ο ν π ε λ  χ υ λ ασ
µ υ ψ δ ε λ γ αδ ασ.
HETP vs VELOCIDAD LINEAL DE FLUJO DE LOS GASES
ACARREADORES EN LAS COLUMNAS CAPILARES.

Nitrógeno
HETP

Flujo óptimo Helio

Hidrógeno

µ ε ν χµ / σε γ .
 GAS ACARREADOR vs RESOLUCIÓN.

Helio
Nitrógeno Hidrógeno

Columna de 15 m x
250 m, con película
de SE-52 de 0.25m.
Flujo de 58 cm / seg.
Isoterma a 150C.

R=0 R = 1.17 R = 1.37

CONSIDERACIONES EN LA CROMATOGRAFÍA CAPILAR.
◆Debido a que al aumentar la velocidad lineal de flujo del
hidrógeno o del helio, prácticamente no ocurren cambios
en la HETP, son los gases acarreadores de elección. Con
ellos es posible trabajar a flujos bastante superiores al de
su valor óptimo.
◆La carencia de soportes activos que puedan actuar como
catalizadores, permite el uso de hidrógeno molecular, sin
riesgos de que ocurran reducciones.
◆En términos generales se trabaja a menor temperatura que
con las columnas empacadas.
◆Se emplea número de platos efectivos.

 tR ' 
N ef = 16  
W 
 FASES ESTACIONARIAS PARA COLUMNAS
DE SÍLICE FUNDIDA.

Composición Polaridad Alternativa Límite Aplicaciones

* en °C
100 % goma de No polar OV-1, -60 a 325 Fenoles, hidrocarburos,
dimetilpolisiloxano SE-30 aminas, pesticidas, PCBs,
compuestos de azufre.
100 % fluido de No polar OV-101, 0 a 280 Derivados de aminoácidos,
dimetilpolisiloxano SP-2100 aceites esenciales.
5 % fenil y 95 % No polar SE-52 -60 a 325 Ácidos grasos, alcaloides,
dimetilpolisiloxano OV-23 ésteres metílicos, drogas,
SE-54 compuestos halogenados.
14 % cianopropil y Intermedia OV-1701 -20 a 280 Drogas, esteroides,
fenilpolisiloxano pesticidas.
50 % fenil y 50 % Intermedia OV-17 60 a 240 Drogas, esteroides,
metilpolisiloxano pesticidas, glicoles.

* Similar número de McReynold’s.

 FASES ESTACIONARIAS PARA COLUMNAS
DE SÍLICE FUNDIDA - 2.

Composición Polaridad Alternativa Límite Aplicaciones

* en °C
50 % cianopropil Intermedia OV-225 60 a 240 Ácidos grasos, ésteres
metil y 50 % fenil metílicos, acetatos de
metilpolisiloxano aditoles.
50 % trifluoropropil Intermedia OV-210 45 a 240 Aromáticos, compuestos
polisiloxano halogenados.
Polietilenglicol Polar OV-351 60 a 240 Ácidos, alcoholes,
modificado con SP-1000 aldehídos, acrilatos,
TPA cetonas, nitrilos.
Polietilenglicol Polar Carbowax 60 a 220 Ácidos, alcoholes,
20 M éteres, aceites esenciales,
glicoles, solventes

* Similar número de McReynold’s.

 PRESERVACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO
DE LAS COLUMNAS.
◆Las columnas se deterioran rápidamente por exposición
a temperaturas altas en ausencia de un flujo constante
de gas acarreador. La vida útil de cualquier columna se
alarga al desalojar el oxígeno adsorbido, con una purga
de gas acarreador durante 5 minutos, antes llevarla a su
temperatura de operación.
◆Las columnas nuevas y las que puedan tener efecto
memoria de corridas anteriores, deben someterse a una
etapa de acondicionamiento 30°Χ π ο ρ δ ε β α ϕ ο
δ ε συ τ ε µ π ε ρ ατ υ ρ α λ  µ ι τ ε ,
durante X horas, η α σ τ α estabilizar la línea base.
∆υ ρ αν τ ε ε λ π ρ ο χ ε σο ε λ
δ ε τ ε χ τ ο ρ ε σ τ αρ 〈
δ ε σχ ο ν ε χ τ αδ ο , ψ ε λ φ λ υ ϕο δ ε λ
αχ αρ ρ ε αδ ο ρ σ ε ρ 〈 ε λ υ συ αλ .
PROPIEDADES Y CARACTERÍSTICAS DE LAS COLUMNAS
PARA CROMATOGRAFÍA DE GASES.

FSOT WCOT SCOT Empacada

Longitud, m. 10-100 10-100 10-100 1-6
Diámetro interno, mm. 0.1-0.53 0.25-0.75 0.5 2-4
Eficiencia, platos/m. 2000-4000 1000-4000 600-1200 500-1000
Cantidad de muestra, ng. 10-75 10-1000 10-1000 10-106
Presión relativa. Baja Baja Baja Alta
Velocidad relativa. Rápida Rápida Rápida Lenta
Inactividad química. Excelente Muy buena Buena Mala
Flexible. Si No No No

FSOT Columna capilar de sílice fundida.

WCOT Columna capilar de pared recubierta.
SCOT Columna capilar con soporte recubierto.
  FASES ESTACIONARIAS POLIMERIZADAS
 0 ENTRECRUZADAS (CROSS-LINKING).


◆ Se producen por la unión entre tramos individuales de

fase estacionaria. Así las macromoléculas forman una
película más estable. En los cromatogramas
realizados a temperatura elevada, no se elimina el
sangrado, pero se minimiza al emplear columnas con
poco volumen de fase entrecruzada, películas de
0.1µ µ ο µ 〈σ δ ε λ γ α δ α σ .
◆ El entrecruzamiento se lleva a cabo in situ después que
la columna ha sido recubierta con una fase metilada,
por la adición de peróxido. Al calentarse la película se
inicia la reacción de radicales libres, entre los metilos
de la fase estacionaria, formandose nuevos enlaces
C-C.
 FASES ESTACIONARIAS
ENLAZADAS (BONDING).

◆Obtener una fase enlazada implica, producir la unión

química de la fase estacionaria a la superficie de la
sílice fundida. De esta forma se elimina el sangrado,
aún cuando se lave la columna con disolventes.
◆El lavado de las columnas con disolventes debe
realizarse, cuando las columnas están muy sucias. Así
se eliminan los residuos de corridas anteriores.
◆Por ser procesos patentados, la naturaleza de las
reacciones que se utilizan en las columnas enlazadas
comerciales se mantiene en secreto.
 RECUBRIMIENTO EXTERNO DE LAS
COLUMNAS DE SÍLICE FUNDIDA.
Para prevenir el deterioro de las columnas de sílice fundida por
efecto de la humedad, el tubo capilar se cubre exteriormente
con poliimida. Así se evitan, las fracturas de la columna, y la
formación de grupos silanol.
H H
El empleo continuo de
O temperaturas superiores a
O O O O
380 C degrada en pocos
Si Si Si Si Si días a la poliimida. Este
problema se previene al
añadir un recubrimiento
O O H HO de aluminio a la columna
O O de sílice fundida.
Si Si Si Si Si
 DIÁMETROS, PELÍCULAS Y CAPACIDADES DE
LAS COLUMNAS CAPILARES.

◆Columna de ultra-alta resolución.- Su diámetro interno va

de 100 a 200 µ µ . La película es menor de 0.25 µ µ . La
capacidad de muestra está entre 1 y 10 ng.
◆Capilares convencionales.- El diámetro interno es de 200 a
350 µ µ . La película generalmente es de 0.25 ó de 0.32
µ µ . Λ α capacidad de muestra es de 10 a 300 ng.
◆De alta capacidad de muestra.- Usualmente el diámetro
interno es de 530 µ µ , y la película de 5 µ µ .
Π υ ε δ ε ν ρ ε σ ι σ τ ι ρ χ α ρ γ α σ δ ε 1000
ν γ δ ε µ υ ε στ ρ α.
◆Μ ι ε ν τ ρ α σ ε λ ε σπ ε σο ρ δ ε λ α
π ε λ  χ υ λ α χ ρ ε χ ε
αρ ι τ µ  τ ι χ αµ ε ν τ ε λ α
χ απ αχ ι δ αδ δ ε µ υ ε στ ρ α
αυ µ ε ν τ α λ ο γ αρ  τ µ ι χ αµ ε ν τ ε .
INCREMENTO DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA.

Columna de sílice fundida de

10 m x 100  m. Con película
de 0.17 m, de fenilmetil
silicona entrecruzada al 5 %.

Con 8 ng de muestra se
alcanza la capacidad de
esta columna.

0.8 ng 8 ng 48 ng
 DEGRADACIÓN DE LA MUESTRA POR EFECTO
DE LA TEMPERATURA DEL INYECTOR.
Inyector a 200°C Inyector a 300°C
d

b b c d
c
f
a a
e d1 e f
f1

Nótese que al aumentar la temperatura los componentes termolábiles

d y f disminuyen, pero aparecen sus productos de degradación d1 y f1
SISTEMA DE INYECCIÓN AUTOMÁTICO.
 CONDICIONES PARA LA DERIVACIÓN.

◆El tiempo para concluir una reacción depende de: la

presión, la reactividad de los agentes empleados, la
naturaleza de los disolventes, y la estructura de los
analitos que se quieren derivar.
◆Es necesario conocer la pureza de los reactivos y
disolventes, así como la estabilidad y volatilidad de los
derivados.

◆Es muy importante extremar precauciones durante los

tratamientos térmicos, para disminuir o evitar pérdidas,
especialmente si ya se obtuvo el derivado volátil.
◆Mientras mayor sea la manipulación de la muestra,
menor exactitud y precisión se tendrá en el análisis.
  MUESTRAS EN LA CROMATOGRAFÍA DE GASES.


◆ Se pueden separar y analizar sustancias gaseosas o en

fase de vapor. Si las muestras se vaporizan dentro del
instrumento, es más apropiado hablar de
cromatografía en fase de vapor.


◆ A mayor peso molecular mayor punto de ebullición. El

20 % de los compuestos orgánicos poseen presiones
de vapor elevadas y pesos moleculares menores de
500. Esto los hace volátiles a las temperaturas de
operación del cromatógrafo de gases.


◆ Muchas sustancias que en su forma monomérica tienen

pesos moleculares bajos, pueden a través de puentes
de hidrógeno intermoleculares, formar conglomerados
de varias unidades, ya sea entre moléculas de la
muestra, o entre ellas y el solvente. Esto las convierte
en especies no volátiles.
 DERIVACIÓN EN LA CROMATOGRAFÍA DE GASES.


◆ Su objetivo principal es abatir los puntos de ebullición,

mediante la disociación de los puentes de hidrógeno.


◆ Las sustancias de elevada polaridad, que tienen pares

electrónicos no compartidos, y poseen hidrógenos
activos de O-H, N-H o S-H, forman puentes de
hidrógeno.


◆ La opción para suprimir estas asociaciones, es sustituir

los hidrógenos activos por grupos alquilo, acilo o
silano.


◆ Con el fin de incrementar la rapidez y el rendimiento de

las reacciones es frecuente el uso de reactivos
clorados, o mejor aún, fluorados.
 DERIVACIÓN EN LA CROMATOGRAFÍA DE GASES - 2.

◆La derivación de compuestos que poseen más de un tipo

de hidrógeno activo, como es el caso de los aminoácidos,
puede implicar: la alquilación del carboxilo y la acetilación
del grupo amino.

◆Aún cuando es posible derivar muchas sustancias, es

pertinente recordar que, los porcentajes de recuperación
rara vez alcanzan su valor máximo.

◆En el análisis de sustancias no volátiles, pero sí solubles,

es mejor emplear métodos de HPLC.

◆En algunos casos, el empleo de disolventes apróticos

produce la disociación de los puentes de hidrógeno, si
estos son intermoleculares, pero no los intramoleculares.
 DERIVACIÓN EN LA CROMATOGRAFÍA DE GASES - 3.

◆Aunque en la cromatografía de gases es poco empleada

la derivación como medio de protección de grupos. Es
importante cuando se analizan corticoides que poseen
grupos laterales lábiles a la temperatura y los ácidos.
◆Debe tenerse presente que las posiciones bencílicas y
alílicas pueden experimentar rupturas térmicas. Si esto
sucede, los picos del cromatograma son artefactos que
se deben a la pirólisis. Aunque es poco probable, si hay
presencia de oxígeno se puede producir combustión.
◆Diversos compuestos como los fenoles, barbitúricos y
esteroles, que en el pasado se tenían que derivar para
analizarlos usando columnas empacadas, actualmente se
determinan sin derivar empleando columnas capilares.
 OTROS OBJETIVOS DE LA DERIVACIÓN.
◆Además de incrementar la volatilidad y proteger a las
funciones termolábiles, la derivación algunas veces
puede usarse para:
◆Disminuir la retención de los componentes de alta
polaridad en la columna, previniendo así el coleo. Por
ejemplo, se pueden derivar los grupos silanol que se
forman en la superficie de la sílice de la columna, con
hexametildisilazano y/o clorotrimetilsilano.
◆Causar señal o incrementar la sensibilidad de los
analitos en un detector determinado.
◆Mejorar la separación de los componentes de la
muestra, o propiciar la resolución de mezclas de
enantiómeros.
Reactivos para derivación
en cromatografía de gases

s ot ar di hobr a C
s ani mA
s odi c áoni mA
s el ohocl A

s odi c Á
s edi or et s E
s ani mati V
s el one F
Anhídrido heptafluorobutírico
Anhídrido trifluoroacético
Bis(trimetilsilil)acetamida
Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
Trifluoruro de boro metanol
Clorotrimetilsilano
Hexametildisilazano
Triclorometilsilano
N-trimetilsililacetamida
 PROBLEMAS DE LA LÍNEA BASE.
E s p ig a s S p ik in gP.-e rt u rb a c io n e s e lé c tr ic a s e n la s lín e a s
d e p o d e r d e b id a s a a is la m ie n t o s d e fe c t u o s o s ,
fa ls o s c o n ta c to s y p r o b le m a s e n e l s is te m a d e
p r o c e s a m ie n t o d e la s e ñ a l.
R u id o N o is e .-L a v a r ia c ió n e rr á t ic a d e la s e ñ a l s e
p r o d u c e p o r d e fe c to s e n la t a r je ta d e l d e t e c to r o
p o r in t e r fe r e n c ia s d e e q u ip o s c e rc a n o s.
O n d u la c ióWn a n d e rL.-a s v a r ia c io n e s a m b ie n t a le s c íc lic a s
im p o rt a n t e s o r ig in a n e s te t ip o d e p ro b le m a . P o r
e je m p lo , e l c a m b io d e te m p e r a t u r a e n e l T C D .
 PROBLEMAS DE LA LÍNEA BASE - 2.
◆Shift.- Los cambios abruptos que producen la apariencia
de escalones, generalmente se deben a conexiones
inapropiadas a lo largo del trayecto de la señal, pero
pueden ocurrir por pequeños movimientos mecánicos.

◆Drift.- El descenso gradual de la línea base se debe a

interferencias químicas en el detector o a la infiltración de
contaminantes en el gas de soporte. Aún que es poco
probable, dichos contaminantes pueden producir el
acenso de la línea base.
INSTALACIÓN DE LA COLUMNA.
Colocación errónea La columna está correctamente
de la columna en el colocada en el inyector y el FID.
puerto de inyección.