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Restricción
Electroforesis.
Separar los fragmentos usando electroforésis.
Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes
enzimas de restricción.
Enzimologia
Enzimas:
Energia de Activacion
Restriccion
Enzimologia
Enzimas:
Energia de Activacion
Restriccion
Historia
Diferentes tipos
– Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA
en sitios no específicos > de 1,000 pb
– Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan
dentro de la secuencia
– Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y
cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio
Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la
biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las
secuencias especificas
Enzimas de restricción
También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a
partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?)
La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que
se lee igual en ambas direcciones).
Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa
para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I
toman el nombre de las bacterias que la producen:
– EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzimas de Restriccion
•Llamadas enzimas de restricción porque restringen la
actividad de bacteriófagos
•“Sistema inmunológico” de las bacterias
•Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la
bacteria y lo metila
•enzimas de restricción solo atacan secuencias no metiladas
(“restriction/modification systems”)
Enzimas de Restricción
Buffer
(10X) 2 μL
DNA (1 μg) 1 μL
Enzimas 2 unidades
H2O _________
20 μL Volumen total
Continúa.
Discontinúa.
Preparación del “gel” Agarosa
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)
Como la agarosa no
es soluble con el
amortiguador a
temperatura
ambiente tiene que
ser hervida.
Preparación de gel:
La mezcla de agarosa y
buffer tiene que
ponerse a calentar,
agitando
frecuentemente hasta
que llegue al punto
donde comience a
hervir.
Preparación de gel:
Consiste de:
bandeja
soporte
peineta
Aparato de “gel” (Cont.)
Eltanque es llenado
con amortiguador.
– 1X TAE
Aparato de “gel” (Cont.)
El“gel” agarosa es
cargado con
muestras de ADN.
Organización del gel cargado con
λ ADN/Enzimas de restricción
Marcador λ DNA/Eco RI A B C D E F
λ DNA/KPN I
λ DNA/ECO RI
λ DNA/HIN DIII
λ DNA/BAM HI
λ DNA uncut
Marcador
Aparato de “gel” (Cont.)
Campo eléctrico.
– 100 V
– 30-45 minutos
Aparato de “gel” (Cont.)
Distancia migratoria.
Aparato de “gel” (Cont.)
El “gel”es colocado
en un
transluminador con
luz UV.
Aparato de “gel” (Cont.)
Partículas de ADN.
Cortar las bandas
– Guardar en
microtubos
rotular
¿Preguntas?
Preguntas