MÉTODOS DE

OBTENCIÓN DE MO´S

NOMBRES: LALESHKA ALEJANDRA ARENAS ENRIQUEZ 2015-118033

MARIA ELIZABETH CUTIPA MAMANI 2015-118049
ESTEFANY DALILA DELGADO LIENDO 2013-38177
VALERIA SOFIA PAMO PÉREZ 2015-118015
LUIS LUZA LOPEZ 2014-118026
En un ecosistema microbiano las células individuales forman
poblaciones.

Las poblaciones relacionadas metabólicamente constituyen gremios.

Los conjuntos de gremios que llevan a cabo procesos fisiológicos

complementarios interaccionan para formar comunidades microbianas.

Estas comunidades interaccionan a su vez, con comunidades de

macroorganismos y definen el conjunto de ecosistema.
 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA BIODIVERSIDAD

MICROAMBIENTE NATURAL

La producción de células en el ambiente es mucho menor que en el laboratorio, debido a algunas características
del medio natural:

 Disponibilidad de nutrientes, suele ser baja.

 La distribución de dichos nutrientes a lo largo del hábitat microbiano no suele ser uniforme.

 Salvo raras excepciones los microorganismos no se encuentran en cultivos axénicos en los medios
naturales, por lo que deben competir por los nutrientes. 
MÉTODO DE ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO

Este proceso consiste en separar los organismos de interés de una comunidad microbiana, un procedimiento
que se conoce como ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos después en un cultivo axénico.

El aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio
y para su aplicación en biotecnología y microbiología ambiental e industrial.
• Este método requiere que el medio de cultivo y las condiciones de incubación sean selectivos para el organismo
que se desea aislar y contraselectivos para los organismos no deseados.

• Por tanto se necesita reproducir lo más fielmente posible los recursos y las condiciones que se dan en este nicho
ecológico y buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat capaces de desarrollarse en las condiciones
de enriquecimiento seleccionadas.

• Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es necesario contar con un inóculo apropiado (una muestra
que contenga el microorganismo). Por tanto, la metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia con la
elección del hábitat adecuado.

• El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inóculo directamente en un medio altamente

selectivo (muchos de los procariotas más frecuentes pueden aislarse de esta manera).

• Tanto el medio de cultivo como las condiciones de incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo de
enriquecimiento (es decir deben optimizarse tanto los recursos como las condiciones para tener las mejores
posibilidades de enriquecer el microorganismo que interesa.
 COLUMNA DE WINOGRADSKY

Se diseñó en 1880 para estudiar M.O. anaeróbicos del suelo, pero representa un
sistema útil para tener una reserva de diversos procariotas a largo plazo.

Se prepara con lodo rico en materia orgánica incluyendo paja, restos de papel, serrín,
hojarasca, carne picada, huevo duro, etc. Se agrega algo de CaSO4 y CaCO3. Se
aprieta y se cubre con agua de un lago y se tapa. Se coloca frente a una ventana
orientada al norte.

Se ha utilizado como medio de enriquecimiento para diversos procariotas, tanto

aeróbicos como anaeróbicos.

Permite añadirle cualquier compuesto cuya degradación se desee estudiar, y luego

seleccionar los microorganismos que realizan tal degradación.

La columna se asemeja mas al ambiente natural que los medios de cultivo.

CULTIVO
AXÉNICO
Consiste en una sola
especie microbiana
Este cultivo se emplea para
hongos y bacterias
La obtención de un cultivo
axénico consiste en dos etapas.
• La primera, hay
que esterilizar todos los materiales
para eliminar todos
los microorganismos presentes en
ellos.
• La segunda, hay que aislar
y cultivar un solo micro-
organismo, para producir un  clon
o De una colonia bien aislada, y repitiendo el proceso varias veces, se puede traspasar a un medio líquido.
o Posteriormente se requiere hacer pruebas microscópicas y metabólicas para verificar pureza del cultivo.
LOS MÉTODOS MAS EMPLEADOS SON:
SIEMBRA POR ESTRÍAS
 Siembra de MOs en placas Petri de agar.
 Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa con un asa
y se extiende formando estrías sobre la superficie en varios
sentidos , cada célula aislada se multiplicara formando una
colonia independiente, cada colonia representa un cultivo
puro .
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD:
 Siembra en tubo de agar
 Dilución de cultivo mixto en tubos de agar fundido
 Las colonias se desarrollan en el interior del agar.
MÉTODOS POR DILUCIÓN
SE UTILIZA PARA REDUCIR LA CONCENTRACIÓN DE MICROORGANISMOS
O CÉLULAS DE UNA MUESTRA.
A PARTIR DE UNA MUESTRA SE VA DILUYENDO HASTA QUE NO SE PRECIE
CRECIMIENTO.
SE OPERA CON DILUCIÓN MÁS ALTA EN LA QUE SE APRECIA EL
CRECIMIENTO
 AISLAMIENTO POR PINZAS OPTICAS:
BIOFOTONICA
• Interacción luz – material biológico, en procesos moleculares, celulares y hasta tisulares.
• Las pinzas ópticas se basan en la captura de micropartículas mediante haces fuertemente enfocados, por ejemplo, con un
objetivo de microscopio 100x.
• Herramienta no invasiva de gran precisión, y poder manipular una sola partícula y separarla de un conjunto sin dañarla
• Generalmente, los efectos térmicos resultado de la absorción de la luz en el medio o en el espécimen a confinar, son efectos
secundarios indeseados, ya que el calor producido puede ocasionar daño (en el caso de microorganismos)
• Aplicaciones de pinzas ópticas, se estudiaron los cambios morfológicos, en crecimiento y propiedades elásticas de hongos
dermatofitos de la especie Trichophyton mentagrophytes, tratados con terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT)
• Las pinzas ópticas permiten medir y ejercer fuerzas menores que las obtenidas con un microscopio de fuerza atómica, así
como producir microdeformaciones de manera no invasiva.
a) Principio de las pinzas ópticas. Un haz de rayos láser fuertemente enfocado sobre un objeto tan pequeño como una
célula bacteriana, crea fuerzas de radiación descendentes (Fa, Fb) sobre la célula, que permiten su desplazamiento en
cualquier dirección mientras esté sometida a la fuerza del haz de rayos láser.
b) Aislamiento. El haz de rayos láser puede enfocarse sobre una célula individual presente en la mezcla de un tubo
capilar, atraparla óptimamente y separarla. Una vez separada lo suficiente de las otras, el capilar se corta, se desconecta
el láser y la célula se coloca en un medio de cultivo estéril.
 ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES
MICROBIANAS

Viabilidad y cuantificación mediante técnicas de tinción.

• El colorante fluorescente DAPI (4´,6-diamido-2- fenilindol) se usa con frecuencia para teñir microorganismos
en hábitat opacos.
• Células teñidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fáciles de ver y contar.
• Tinción con DAPI es ampliamente usada para la enumeración de microorganismos en el ambiente, en alimentos
y en muestras clínicas.
• Para muestras acuáticas las células pueden ser teñidas sobre la superficie de un filtro, después que la muestra
líquida ha sido pasada a través del mismo
• DAPI es un colorante fluorescente inespecífico que tiñe ácidos nucleicos y no suele reaccionar con la materia
inerte. DAPI es una forma razonable de estimar el número de células presentes en una muestra.
• Ventaja: es una técnica sencilla, no es específica (tiñe todos los MOs de una muestra.
• Desventaja: No diferencia entre células vivas y muertas, ni permite el rastreo de organismos específicos en el
ambiente.
 SONDAS MOLECULARES EN COMUNIDADES MICROBIANAS
• Sondas sintéticas de DNA marcadas con fluorescencia que hibridan con secuencias complementarias del
genoma de diversos organismos de una muestra. Se trata de una técnica específica. La utilización de sondas
moleculares diferenciales sirven para estudiar las características de la comunidad. Permiten conocer también la
asociación física de bacterias.
• FISH (Fluorescent in situ hybridization) usado principalmente con comunidades procariontes y permite la
identificación y cuantificación directas de grupos taxonómicos generales o específicos dentro de su ambiente
natural.
• Con FISH todas las células son fijadas y su 16S o 23S rARN se hibridiza con sondas de oligonucleótidos taxón
específicos marcados con fluorescencia. Posteriormente, las células que hibridaron y quedaron marcadas
fluorescentemente pueden verse en un microscopio óptico de fluorescencia.
• FISH puede usarse para visualizar organismos no cultivados, y es útil para estudiar la distribución ecológica de
los organismos en hábitats diversos. Tal vez el aspecto en el que se debe tener más cuidado al usar FISH es el
diseño de la secuencia de las sondas de hibridación, ya que de ello depende la caracterización de la comunidad.
 ANTICUERPOS
FLUORESCENTES
• El uso de anticuerpos fluorescentes permite la identificación de un determinado M.O.

• Los cuales se unen específicamente a constituyentes de la superficie celular.

• Los anticuerpos pueden hacerse fluorescentes uniéndolos covalentemente a compuestos

orgánicos fluorescentes como rodamina B de fluorescencia roja o isotiocianato de
fluoresceína que da una fluorescencia amarilla verdosa.

• Esta técnica es muy útil en ecología microbiana, donde representa uno de los pocos métodos
que existe para la identificación directa de células microbianas en ambientes naturales.

• Se utilizan dos técnicas de tinción distintas de anticuerpos fluorescentes, la directa y la

indirecta.

• En la directa es el propio anticuerpo contra el M.O. que es fluorescente.

 TINCION Y
ANTICUERPOS
FLUORECENTES
El uso de anticuerpos fluorescentes permite la identificación de un
determinado M.O. los cuales unen específicamente a constituyentes de la
superficie celular.

Los anticuerpos pueden hacerse fluorescentes uniéndolos covalentemente a compuestos

orgánicos fluorescentes como rodamina B de fluorescencia roja o isotiocianato de
fluoresceína que da una fluorescencia amarilla verdosa.

En este método la presencia de un anticuerpo

En la directa es el
no fluorescente sobre la superficie de la célula propio anticuerpo
se detecta mediante un anticuerpo fluorescente contra el M.O. que es
dirigido contra el anticuerpo no fluorescente. fluorescente.
 MÉTODO DE TINCIÓN INDIRECTA
En este método la presencia de un anticuerpo no fluorescente sobre la superficie de la célula se detecta
mediante un anticuerpo fluorescente dirigido contra el anticuerpo no fluorescente.

Esto se consigue inmunizando un conejo con bacterias, el que producirá globulinas específicas. Luego
se utilizan Iglob anti-conejo marcadas con un colorante fluorescente.

La ventaja de este método es que no se requiere un anticuerpo marcado para cada antígeno (bacteria) a
determinar.