CITOMETRIA DE

FLUJO

DR. ROGER ALDO CENTENO DÍAZ

DOCENTE DE LA CÁTEDRA DE PATOLOGÍA GRAL
MÉDICO PATÓLOGO CMP 43426 – RNE 29731
ESPECIALIZACIÓN POR LA UNIV. CAYETANO HEREDIA
MAESTRÍA EN DOCENCIA E INVESTIGACIÓN UNMSM
PATÓLOGO DEL LA UTR HOSPITAL CAYETANO – LIMA
JEFE DEL LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
PATÓLOGO DEL HOSPITAL REGIONAL DE HUACHO
JEFE DEL SERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA
 CITOMETRIA DE FLUJO
• ES UNA TECNOLOGÍA BIOFÍSICA QUE UTILIZA LUZ LÁSER.
• EMPLEADA EN EL RECUENTO Y CLASIFICACIÓN DE CÉLULAS
SEGÚN SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, PRESENCIA
DE BIOMARCADORES, Y EN INGENIERÍA DE PROTEÍNAS.
• ANÁLISIS MULTIPARAMÉTRICO SIMULTÁNEO DE OTRAS
CARACTERÍSTICAS FÍSICOQUÍMICAS, EVALUANDO EN
PROMEDIO > 2000 PARTÍCULAS/SEGUNDO.
Heterogeneidad
Heterogeneidad celular en elensistema
celular inmune
el sistema
T4 T8 NK B Mono Neu
CD45

CD2 CD19 CD14 CD15

CD3

CD56

CD4 CD8

CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

Criterios de caracterización de los tipos celulares

– Celulares
• Morfología al microscopio.
– Moleculares
• Genotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas
• Fenotípico (Proteoma) RNA expresado, proteínas.

Antígenos de diferenciación linfocitaria

Los antígenos de superficie pueden ser utilizados como
marcadores específicos de líneas, tipos y subtipos
celulares.
Morfología y antígenos de diferenciación en el
análisis de la heterogeneidad celular
Granulocitos Monocitos
CD15+ CD14+

Linfocitos
CD3+
T2ab
T1gd
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
CD5+
0 256 512 768 1024
FSC-Height -> CD5-
4C5144001
 ¿Qué es la citometría de flujo?
Amplificación Representación
digitalización y Análisis

Meeting point
FSC
Láser
2- 4º
90º
l uz
de Columna
re s
to de muestra
t ec
c
ss De

Flujo
CITOMETRIA DE FLUJO
 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE
FLUJO
- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de
células individuales (miles).
- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y
en la precisión de las medidas.
- A menor tiempo de dedicación mayor productividad.

DESVENTAJAS
La citometría de flujo no aporta información sobre la
distribución espacial de las células estudiadas.
Citómetro de flujo
 ¿Cómo funciona un citómetro?

• Sistema de flujo
• Dispersión de la luz
• Fluorescencia
• Separación y detección de la luz
• Amplificación
• Corrección de errores: solapamiento espectral y
formación de dobletes
• Digitalización y almacenamiento de la información.
SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA

AIRE

MUESTRA

FLUJO
MUESTRA
Luz incidente
FSC
90º Luz dispersada hacia delante, a=2- 4º

Luz dispersada lateralmente

y luz fluorescente, a = 90º

Cámara
de flujo

Columna
de muestra
Fluido envolvente
INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ

- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:

- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA

- PROPIEDADES FLUORESCENTES:
- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)
 Luz dispersada a 90 grados

Laser

Detector

Detector de 90º
DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE
(FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)

SSC

FSC

El detector de FSC convierte luz dispersada

hacia delante en un pulso de voltaje
proporcional al tamaño de la célula/particula
DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE
(SIDE SCATTERED LIGHT, SSC)

SSC

FSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada

lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al
contenido en orgánulos membranosos (granularidad)
Morfología y antígenos de diferenciación en el
análisis de la heterogeneidad celular
Granulocitos Monocitos
CD15+ CD14+

Linfocitos
CD3+
T2ab
T1gd
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
0 256 512 768 1024
CD5+
FSC-Height ->
4C5144001
CD5-
Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y
CD3 Percp
Fluorocromos
 Optica en los citómetros de flujo
PMT
4

Filtros PMT
Dicroicos 3
Flujo Celular
PMT
2
Bandpass
Filtros
PMT
1

Laser
Laseres 350 457 488 514 610 632
comunes 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PE-TR Conj.

Texas Red

PI

Etidio

PE

FITC

Acido Parinárico
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA
TC
Cy5
Fluorocromos PerCP
APC
QR

Detectores FL-1 FL-2 FL-3 FL-4

 Amplificación de señales
• Lineal
• (intervalos regulares)
• apropiada para:
– Señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
– Con distribuciones con picos estrechos como el
contenido en DNA.
• Logarítmica
• (intervalos crecientes)
– Cubre un rango más amplio de variación de la
señal (0-10.000).

10 100 200 1 10 200

10 100 200 1000 10 100 200 1000

 Escalas

FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica

 DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO
DE INFORMACIÓN
N FSC SSC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 TIEMPO

1 2 1 1 1 1 2 1
2 2 1 1 2 3 2 1
3 3 2 3 3 3 3 1
4 4 2 4 1 4 3 1
5 3 1 1 2 1 5 2
6 4 2 1 3 1 5 2
7 2 3 2 1 3 1 2
8 2 8 1 2 4 2 2
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
10000
Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales
digitales
Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo
listado (almacenamiento multiparamétrico).
 PROCESO DE INFORMACION

Histogramas
Diagramas biparamétricos
Representación monoparamétrica de
datos.
Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de
fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

M1
Histogramas
FL-1

SSC

FL-2

FSC
FL-3
 Representación biparamétrica en 2D
Diagrama de puntos / dot plot

Representación -+
simultánea de dos
parámetros X e Y. FL-2 ++
X representa el valor de la
señal de un parámetro.

Y representa el valor de la - - FL-1 +-

señal del otro.
 Representación 3D
Countour plot / Diagramas de contornos
X, Y más una tercera dimensión.

Una superficie tridimensional

La altura representa el
número de células con una
determinada combinación de
ambos parámetros.
Diagrama de dot plot density
 Selección de la información
Gates (Puertas) / ventanas (windows)

Selección de subpoblaciones
definidas en diagramas
monoparamétricos M2

Sitúan los valores límite M1

superior e inferior de un
parámetro que definen a las
células de interés.
 Gates lógicos / Puertas lógicas
Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente
como criterio para seleccionar las células de interés.

R1
NK
GRANULOCITOS
R7 R3
COMPLEJIDAD CELULAR

TK
R2

MONOCITOS
R6
LINFOCITOS
T
R4

R5

R5 and R1
TAMAÑO
 Análisis de la información.
Estadísticas
monoparamétricas
M2

M1

Histogram Statistics

File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear Values

Tube: Panel:
Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3
Gated Events: 9917 Total Events: 10000
X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97 1252
M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44 1252
M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12 57
Estadísticas biparamétricas
• Cuadrantes Combinación de dos
+- ++
umbrales de positividad para dos

parámetros

• Número de células
-- +-
Quadrant Statistics
• % de células File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: tube #7 Panel: Bronquiris
• MFI mean, geo mean Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate
Gated Events: 5000 Total Events: 5000
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
Quad Location: 15, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
 Estadística por regiones

• Selección libre de un Microbeads

R2
conjunto de

combinaciones de valores
Linfocitos
R1
correspondientes a dos

parámetros.
Información generada de una muestra
marcada en triple color

Quadrant Statistics
Quadrant Statistics Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID: File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Sample ID: Patient ID: Sample ID: Patient ID:
Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Tube: tube #7 Panel: Bronquiris
Gated Events: 5000 Total Events: 5000 Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log) Gated Events: 5000 Total Events: 5000 Gated Events: 5000 Total Events: 5000
Quad Location: 15, 17 X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log) X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
Quad Location: 15, 17 Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05 UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92 UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17 UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05 UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43 LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17 LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43 LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43

Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12-24 níme
CITOMETRIA DE FLUJO
 CITOMETRIA DE FLUJO
• USOS:
– TRASPLANTES.
– HEMATOLOGIA.
– DIAGNOSTICO PRENATAL.
– INMUNOLOGIA TUMORAL.
– GENETICA
– SELECCION DE ESPERMA.
MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCIÓN