Chromatographie

sur colonne

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La chromatographie sur colonne est une méthode de
purification couramment utilisée en chimie organique
afin de séparer les constituants d’un mélange.

Contrairement à la chromatographie sur couche mince

(CCM) qui est une technique essentiellement
analytique, la chromatographie sur colonne est
utilisée en chimie préparative. Elle permet, en effet,
de purifier une quantité importante de produit
(pouvant aller jusqu’à plusieurs grammes) pour une
utilisation ultérieure en synthèse.
Principe de la technique
La séparation des produits d’un mélange
repose sur les mêmes principes que la CCM, à
savoir leurs affinités relatives pour une phase
mobile et une phase stationnaire. Lors d’une
chromatographie sur colonne, l’adsorbant
placé dans la colonne constitue la phase
stationnaire tandis que l’éluant qui se déplace
par gravité (et parfois sous l’effet d’une
surpression) constitue la phase mobile.
Choix de l’éluant

Comme en CCM, l’éluant (caractérisé par sa

polarité) est choisi en fonction de la nature des
molécules à séparer. Des mélanges de
différents solvants peuvent être réalisés pour
ajuster la polarité de l’éluant.
CCM préparatoires

Avant d’entreprendre une chromatographie sur

colonne, des CCM sont réalisées avec des éluants
différents afin de déterminer les conditions de
séparation optimales.
Une bonne séparation nécessite que :
les composés ne migrent pas au-delà du premier
tiers de la plaque ;
les taches soient suffisamment séparées.
On donne ci-dessous trois exemples de CCM
réalisées dans trois éluants différents avec la
même phase stationnaire :
Mélange de solvants et gradient de polarité

Si l’éluant est un mélange de solvants, la

séparation peut être réalisée soit en utilisant le
même mélange tout au long de l’élution, soit en
augmentant graduellement la polarité de
l’éluant au cours de l’élution : on réalise alors un
Gradient de polarité. Cette méthode permet
d’entraîner successivement l’ensemble des
composés présents dans le mélange.
Choix de la phase stationnaire

Propriétés acido-basiques des adsorbants

On distingue principalement deux types

d’adsorbant : la silice et l’alumine. La silice
possède un caractère acide alors que l’alumine
existe sous des formes acide, basique ou
neutre.
Le choix de l’adsorbant dépend ainsi de la
stabilité des produits à chromatographier.
Quantité d’adsorbant utilisée
La quantité d’adsorbant utilisée dépend
principalement de deux facteurs : la masse de
l’échantillon à purifier et la difficulté de la
séparation. Le tableau suivant indique la
quantité approximative d’adsorbant utilisée par
gramme d’échantillon à purifier :
Mise en œuvre pratique
Préparation de l’adsorbant
L’adsorbant n’est pas introduit en poudre dans la
colonne mais sous la forme d’un gel (mélange
d’adsorbant et d’éluant).
Le gel est préparé en ajoutant par pipettes
portions l’adsorbant dans un bécher contenant
l’éluant. Le mélange est homogénéisé à chaque
ajout à l’aide d’une baguette de verre. Le gel
obtenu doit être suffisamment fluide pour
pouvoir couler sur les parois de la colonne lors
de son remplissage : la quantité d’éluant utilisée
est ajustée en conséquence.
Remplissage de la colonne
Lors de l'opération de remplissage, le plus délicat
est d'avoir une répartition la plus homogène
possible de l'adsorbant. Il faut éviter : D'avoir des
trous dans le remplissage et des bulles d'air.
 Remplissage à sec

Remplir la colonne aux deux tiers de solvant.

Faire couler l’adsorbant dans la colonne à l’aide d’un
entonnoir en faisant attention à avoir une répartition
homogène dans la colonne.
La colonne est prête lorsque le solvant flottant au
dessus de l’adsorbant est de venu clair.
Remplissage avec le solvant
Préparer une bouillie en mélangeant dans un
bécher l’adsorbant dans le solvant.
Placer cette bouillie dans la colonne à l’aide d’un
entonnoir en faisant attention à avoir une
répartition homogène dans la colonne.
La colonne est prête lorsque le solvant flottant au
dessus de l’adsorbant est devenu clair.
Dépôt du mélange à purifier
À l’aide d’une pipette Pasteur, réaliser le dépôt le plus près
possible de la surface de sable en touchant la paroi de la
colonne avec l’extrémité de la pipette. Faire pivoter
circulairement l’extrémité de la pipette sur la paroi de
manière à obtenir un dépôt cylindrique fin et uniforme.
Élution
Régler le débit en bas de colonne au goutte à goutte
(1 à 2 gouttes par seconde)
Recueillir des fractions de volume constant dans des
tubes numérotés
Suivi de la chromatographie
Au cours de l’élution, des CCM sont réalisées
sur les fractions recueillies afin d’identifier les
composés présents.
Dans le cas de l’utilisation d’un gradient de
solvant, ces CCM permettent aussi de
déterminer le moment où la polarité de
l’éluant peut être augmentée.
Finalement, les fractions correspondant au
produit désiré sont réunies puis le solvant est
éliminé à l’évaporateur rotatif.
Chromato-flash
Dans certaines circonstances, on peut utiliser la
technique de la "chromato-flash", où, pour
gagner du temps, on monte la colonne sur une
fiole à vide branchée sur une pompe.