Kraft-Spektroskopie von c-CPE – Claudin –

Bindungen mit dem Aufbau einer optischen

Pinzette.

CHRISTIAN IRIARTE
Gliederung 2

 Prinzip der optischen Pinzette

 Aufbau
 Anwendungen (Beispiele)
 Silica-Teilchen-Experimente (Position und Force
Calibration)
 Experimente mit MCF-7
 Zusammenfassung
 Wie geht es weiter?
Was ist c-CPE? 3

Was ist Claudin?

Warum ist wichtig die

Analyse von dieser Bindung?
Metodos de ruptura de las 4

conecciones – Porque Opt.

Twe. Y no otros metodos
 AFM –
 Opt. Twe.
 …

 Buscar rupture force F lingand binding (p.e. integrin)

 5
Prinzip der optischen Pinzette
Laserstrahl mit einer hohen numerischen Apertur.
Verhalten wie Hook'sche - Feder
𝐹=−𝑘∗𝑥

ausgeübte Kraft
[wikipedia]

[Caroline Riesenberg: Masterarbeit]

Mittelbare Messung von Kräfte

Abstand von Zentrum der Falle (x)
Prinzip der optischen Pinzette 6

 Gaußstrahl

 Streukraft Fscat in Richtung der Strahlausbreitung

 Gradientkraft Fgrad in Richtung des

Intensitätsgradienten

 Bedingung: [uni-leipzig.de]

⇒Wiederherstellungskräfte Fgrad > Fscat

⇒Objekte können gefangen werden
Aufbau 7

Wesentliche
WesentlicheElemente
Elemente

 Dioden Laser 975 nm
ein Laser

 Thorlabs
Strahlaufweitungs- und –lenkoptik
 Dichrotische Spiegel; Kollimator; Beam expander; Condensor
 NA =1,25
 Objektiv mit hoher NA
 Halterung
 Halterung
 Lichtmikroskopie (CCD-Kamera)
 Mikroskop

2 Columnas sin animacion

Aufbau 8

Waagerechter Pfad Senkrechter Pfad

Setup – kurze Beschreibung – 9

Besseres Foto
Anwendungen-(?? Se puede 10
obviar)
  Fangen von Mikropartikeln, Viren, Bakterien, Zellen und Organellen
 Messung von Kräften im pN – Bereich mit Bewegungen in μm/nm
 Einsatz in der molekularen Biologie, Biochemie und Biophysik

Beispiele

[Moffit et al., 2008]

Zwei
Eine optische
optische Pinzetten:
Pinzette:
Bewegungsabhängigkeit
Biologische Probe an einemvon
Steifigkeit
unbewegten bestimmt
Teilchen befestigen
Kraftmessungen - Kalibrierung 11

Hacer tambien una imagen

  
propia
( 150 nm)

1.
1. Genaue Bestimmung
Bestimmung der der
Verschiebung
Position ist erforderlich
Position calibration
100 nm

[wikipedia]
Back Focal Plane 12

Hacer una imagen de la descripcion del siytema y

mantener el tipo para esta imagen
 Interferenz zwischen durch Probe
transmittiertem Licht und restlichem Licht

 Genaue Lokalisierung und Messung der

Verschiebung

[Thorlabs]
Position calibration –Imagen 13
Propia
• Linearer Fit nahe dem Fallenzentrum
 Position calibration 14
Konvertierungs Konvertierungs
faktor X (um/V) faktor Y (um/V)
5,98E-06 1,24E-05
C onversion factor "β" (m/V )

5,11E-06 1,19E-05
5,46E-06 1,05E-05
Corregir barras
Conversion factor
1.40E-05
de
β vs. Laser power
6,40E-06
3,77E-06
1,01E-05
1,04E-05
4,15E-06 7,27E-06

Error
1.20E-05

1.00E-05
5,47E-06
4,78E-06
4,22E-06
6,99E-06
7,51E-06
4,79E-06

8.00E-06

6.00E-06

4.00E-06

2.00E-06

0.00E+00
0 50 100 150 200 250

Laser power (mW)

Konvertierungsfaktor X (um/V) Konvertierungsfaktor Y (um/V)
Kraftmessungen - Kalibrierung 15

  
( 150 nm)

1. Bestimmung der Position

Position calibration
100 nm
2. Steifigkeitsmessung
Force Calibration
[wikipedia]
 Steifigkeit-Messung 16
Power Spectral Density
-Imagen Propia
  Lorentz function
 corner frequency
 drag coefficient

 Steifigkeit
 Gefangenes Silica-Teilchen 17
d = 1 µm d = 3 µm

Steifigkeit (pN/um)
Steifigkeit (pN/um)

Steifigkeit (d=1um)
160
140 9
Steifigkeit (d=3um)
120
100
Barras de errores 8
7
6
80
60
Marcar las particulas (atrapada y libre) 5
4
40 3
2
20
1
0
0
0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 250
Laserleistung (mW) Laserleistung (mW)
kx (pN/um) Linear (kx (pN/um)) kx (pN/um) Linear (kx (pN/um))
Abstand vom Deckglas 18

P=170mW
140.00

130.00

120.00
Fallensteifigkeit (ρN/μm)

110.00

100.00
Barras de error y verificar el
90.00
tamaño de la fuente
80.00

70.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Abstand (μm)
Deckglassabhängigkeit X Deckglassabhängigkeit Y
 Steifigkeitsmessung (PSD) 19
kx ky
(ρN/μm) (ρN/μm)
1,5 1,6
11,68 12,78
20,47 23,52
Steifigkeit „k“ vs. Laserleistung (Teilchen = 1um) 32,63 36,22
43,55 52,80
55,11 64,08
120

Barras de error y
61,40 74,80
72,51 87,82
100 84,51 104,27

80
tamaño de fuente
Steifigkeit [pN/um]

60

40

20

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Kx Linear (Kx)
Laserleistung [mW]
Ky Linear (Ky)
Fehlerursachen 20

 Systematische Fehler
 Linsen Verformung der Airy Pattern
 Dreck

 kleine Unterschiede in der QPD Fehler

Teilchengröße

 Abstand vom Deckglas Steifigkeit

Gefangenes 21

Silica-Teilchen – MCF7
 Silica – Teilchen
 Streptavidin + c – CPE

 Zellen: MCF – 7
 Claudin

 Bindung: c – CPE - Claudin

Desribir el programa de 22

LabVIEW
 Como funciona internamente
 Parametros que se introducen
 Que hace el sistema
Kraftspektroskopie 23

Experimente mit Zellen

-Mejorar el video
Kraftspektroskopie 24

Analyse von Kräften

Ergebnisse erster Messungen 25

 Anzahl an Zellen:
11 14
Bindungen mit CCPE Bindungen chne CCPE
# Bindungen Teil-% %-Total # Bindungen Teil-% %-Total
6 22,22 14,63 0 0,00 0,00
15 55,56 36,59 9 64,29 21,95
0 0,00 0,00 3 21,43 7,32

4 14,81 9,76 0 0,00 0,00

1 3,70 2,44 1 7,14 2,44

1 3,70 2,44 0 0,00 0,00
27 100 65,85 0 0,00 0,00
0 0,00 0,00
0 0,00 0,00
1 7,14 2,44
14 100 34,15
Ergebnisse erster Messungen 26
Bindungen mit CCPE Bindungen chne CCPE
CCPE
Bereich
(pN) # Bindungen %-Total
Teil-% # Bindungen %-Total
Teil-%
0-10 6 22,22
14,63 0 0,00
0,00
11-20 15 55,56
36,59 9 64,29
21,95
% Total
Teil-% 21-30 0 0,00 3 21,43
7,32

75.00 31-40 4 14,81

9,76 0 0,00
0,00
40.00
41-50 1 3,70
2,44 1 7,14
2,44
51-60 1 3,70
2,44 0 0,00
0,00
65.00
35.00
61-70 27 65,85
100 0 0,00
0,00
71-80 0 0,00
0,00
55.00
30.00 81-90 0 0,00
0,00
91-100 1 7,14
2,44
14 34,15
100
45.00
25.00
%

35.00
20.00
%

25.00
15.00

10.00
15.00

5.00
5.00

5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105
0.00
-5.00
5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105

Enthaltener Bereich mit CCPE

EnthaltenerBindungen
Bereichmit CCPE
Bindungen
Bindungen chne CCPE
Zusammenfassung 27

 Laserleistung ist proportional zur Steifigkeit

 Die Steifigkeit ist vom Abstand zum Deckglas abhängig

 In den bisherigen Experimenten Bindungswahrscheinlichkeit ca.:

 2,5% (Teilchen beschichtet mit c-CPE)
 1,3% (Teilchen ohne c-CPE)

 Mostrar el promedio de las fuerzas de Ruptura

Wie geht es weiter? 28
Methodenvergleich - Steifigkeitberechnung

Stokes Drag Method PSD Method

Wie geht es weiter? 29

1. Methodenvergleich
 PSD (Power Spectrum Density) - Drag force method
2. Weitere Zellenexperimente
 Ligandenbindungsaffinität
Messung von Brechungskräften
 Weitere Experimente mit MCF – 7
 Mit und ohne c-CPE
 Experimente mit neuen Zellentyp ()
Danke für die Aufmerksamkeit