Distribución de

actividades en Técnicas más utilizadas en I+D:

I+D en
América Latina Cultivo de tejidos 29%
y el Caribe Marcadores moleculares 27%

Diagnóstico 20%

Ingeniería genética 14%

Grandes temas en I+D:

Recursos genéticos 21 %

Mejora de productividad 23 %

Agrobiotecnología Protección de plantas 25 %

Introducción Otros 19 %

Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.

 Biotecnología Vegetal
• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos
• micropropagación
• mejoramiento de plantas
• producción de compuestos de interés comercial
producción de metabolitos secundarios
producción de proteínas
producción de polímeros biodegradables
• establecimiento de plantas transgénicas
plantas resistentes a virus
plantas con rutas metabólicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composición de
proteínas, aceites, etc.
• fitorremediación
remoción de xenobióticos
remoción de metales pesados
Principales • Existen tres conceptos básicos que
conceptos fundamentan el cultivo in vitro de células y
fisiológicos tejidos vegetales:
aplicables a los
cultivos in vitro
- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

- Balance de reguladores del crecimiento

Agrobiotecnología
vegetal
Cultivo de tejidos
vegetales
Fundamentos
• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada
teóricos y
por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda
prácticos del célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
cultivo de entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de
diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones
tejidos específicas referidas al medio del cultivo, relaciones
vegetales hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• La desdiferenciación consiste en la transformación y

pérdida de las características de especialización de un tipo
celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El
siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta
es la redifereciación de las células previamente
desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance

Agrobiotecnología entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Cultivo de tejidos
vegetales
Técnicas
• Micropropagación vegetal
del cultivo
de células • Regeneración de plantas
y tejidos (embriogénesis y organogénesis)
vegetales • Cultivo de meristemas
• Cultivo de suspensiones de células vegetales
• Cultivo de protoplastos
• Cultivo de anteras
• Cultivo de óvulos y embriones

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Medios de cultivo: composición general

Compuestos inorgánicos Reguladores del crecimiento

Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+ , Auxinas
Mg2+ , SO42- Citocininas
Micronutrientes: Fe2+ , Cu2+ , Zn+, Mn2+ , Giberelinas
Mo2+ , Co2+ , I-
Soporte inerte (medios semisólidos)
Carbohidratos Agar (0,7 a 1%)
Sacarosa, glucosa, mio-inositol Gelrite®

Vitaminas pH
Tiamina (B1) 5,6 – 5,8
Piridoxina
Acido nicotínico (C) Esterilización
Biotina 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Aminoácidos
Glicina
Reguladores • Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
del crecimiento - Auxinas
- Citoquininas
- Giberelinas
- Acido abscísico
- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados

están determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento

están presentes en la planta durante todo
su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.
Su concentración relativa varía en función
Agrobiotecnología del estado fisiológico de la planta y en cada
uno de los órganos de ésta.
Cultivo de tejidos
vegetales
- Están involucrados en numerosos procesos
fisiológicos.
 O
Auxinas: estos
Acido indol acético (AIA)
compuestos se OH (auxina endógena)
emplean N

básicamente
• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir
como de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
promotores de responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica
del coleoptile de gramíneas.
la proliferación - Alargamiento y división celular
celular y la - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
- Formación de raíces adventícias
inducción de la - Dominancia apical
- Acción herbicida
morfogénesis - Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el

embrión. La concentración endógena en la planta varía entre
0,001 y 0,1 mg/Kg.
Agrobiotecnología
• Su transporte es polar
Cultivo de tejidos • Auxinas sintéticas:
vegetales
- Acido indol butírico (IBA)
- Acido naftalen acético (ANA)
- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
Citoquininas: • Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias
promotoras de la división celular in vitro.
en combinación
con las auxinas, • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:
determinan - Promoción de la división celular
- Promoción de la organogénesis (relación
diferentes auxinas/citoquininas)
respuestas - Retardo de la senescencia
- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
morfogenéticas
• Citoquininas endógenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:
- Kinetina (Kin)
- Benziladenina (BAP)
Agrobiotecnología
• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran
Cultivo de tejidos
en todos los tejidos. La concentración endógena en
vegetales plantas varía entre 0,1 y 500 µ g/Kg.

• Su transporte es no polar.
Estructura química de las principales citoquininas
CH3
H CH2 CH C
N CH2OH

Zeatina

CH3
H CH2 CH C N
N CH3

Isopenteniladenina
(IP) H

N H N C
H
N N
6-bencilaminopurina

N N
 O
Las giberelinas
Acido giberélico (GA3)
se utilizan para
favorecer el HO
C O
OH
crecimiento y el
H H
alargamiento de CH3 H COOH
los entrenudos CH3

de los brotes • Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz
infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos
de novo entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando
extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En

la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos
o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes
Agrobiotecnología - Germinación de semillas en dormición
- Floración
- Movilización de reservas en la semilla.
Cultivo de tejidos
vegetales
• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.
 • Iniciación
Etapas de la
- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre
micropropagación - Elección del explanto inicial y de la formulación
del medio de cultivo
vegetal - Desinfección superficial de los explantos
- Establecimiento del cultivo in vitro

• Multiplicación

- Multiplicación del material stock

• Enraizamiento

- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

• Rusticación

- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones

de maceta o a campo

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Existen dos
posibles vías • Posibles vías morfogenéticas:
morfogenéticas
implicadas en la - Organogénesis
diferenciación - Embriogénesis
de novo
de brotes y/o • Diferencias entre las dos posibles vías:
plantas - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o
completas cluster de células del explanto inicial se desdiferencia
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas
completas.

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.

Una célula del explanto se aísla y constituye el punto
Agrobiotecnología de partida para la obtención de un embrión somático.
Se diferencian embriones o estructuras bipolares
Cultivo de tejidos que completan cada una de las etapas implicadas
vegetales
en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es
una planta completa.
Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Explanto
(disco de hoja)
Callo Explanto
(células vegetales)

REGENERACIÓN

Suspensión celular

Embriones somáticos
GERMINACIÓN
ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN Semilla
artificial
Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales
Semillas sintéticas de
orquídea obtenidas por
encapsulación en alginato
Propagación
vegetativa a • Proliferación de yemas apicales o axilares
partir de yemas - Consiste en la multiplicación de plantas a partir
preexistentes de las yemas axilares preexistentes.
Representa la aceleración in vitro del crecimiento
natural de dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base

al número de brotes o vástagos obtenidos a partir
de un explanto inicial, entre un repique
y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20
brotes por mes, dependiendo de la especie
en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían

obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año,
a partir de una única yema inicial.
Agrobiotecnología
- El cultivo de meristemas es un caso especial
del uso de esta técnica.
Cultivo de tejidos
vegetales
 Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de tejidos desdiferenciados

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Resulta posible • Consideraciones generales:
regenerar brotes
- Callo: masa de células desdiferenciadas
o yemas a partir obtenidas a partir de un explanto cultivado
de tejidos in vitro (disco de hoja, meristema,
células en suspensión, etc.)
vegetales
desdiferenciados - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir
de estos callos.
in vitro
- Las plantas diferenciadas pueden
no ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerse
en cuenta, especialmente cuando se trabaja en
propagación clonal a gran escala.

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Sistemas de propagación vegetativa in vitro
Regeneración directa e indirecta
Sistemas de
propagación Propagación vegetativa in vitro
Regeneración directa e indirecta
vegetativa
in vitro

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
 Sistemas de micropropagación vegetal
Cultivo de meristemas

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Los meristemas
Los meristemas determinan el crecimiento de
son grupos de
la planta y dan origen a sus diferentes órganos
células
indiferenciadas
que retienen
la capacidad de
dividirse
durante todo el
ciclo de vida de
una planta

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies

vegetales.
Agrobiotecnología
• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in
Cultivo de tejidos
vegetales vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la

criopreservación y conservación de germoplasma.
El cultivo de
meristemas - El domo meristemático no está vascularizado
facilita la (muchos patógenos se translocan por los tejidos
eliminación de de conducción).
patógenos
- El número de partículas virales es menor
en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema

es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo

de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin
Agrobiotecnología entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y
Dahlia.
Cultivo de tejidos
vegetales
Alcances de la
micropropagación • Propagación vegetativa rápida y a gran escala
vegetal
• Uniformidad seleccionada del material clonado

• Multiplicación de plantas recalcitrantes

a las técnicas convencionales

• Reducción en el tiempo de multiplicación

y en el espacio requerido para tal fin

• Mayor control sobre la sanidad del material

propagado

• Introducción rápida de nuevos cultivares

• Conservación de germoplasma
Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos • Facilidades para el intercambio internacional

vegetales
de material vegetal
 Sistemas de transferencia genética
en plantas

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
Sistemas de
• Sistemas de transferencia de ADN basados
transformación
en vectores biológicos
genética
en plantas - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes.

- Sistemas basados en virus vegetales.

• Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalística.

- Transferencia mediada por cationes divalentes

y/o electroporación
Agrobiotecnología
- Transferencia con whiskers de carburo de silicio.
Biobalística
y otros sistemas - Transferencia por microinyección.
de transferencia
directa de ADN
 Biología de Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
 Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium
tumefaciens

Tumor de tallo provocado

por Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
Mapa genético
del plásmido Ti
de octopina

BI BD

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
Estructura de la región T de un plásmido Ti de octopina
Mecanismos moleculares implicados en la transformación
por Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Tzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002

Agrobacterium
rhizogenes
Tumor de raíces producido por Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens Gentileza del Dr. Mark Tepfer
 Cultivo de raíces de tabaco transformadas
Agrobacterium por Agrobacterium rhizogenes
rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens

Gentileza del Dr. Mark Tepfer

La capacidad
de Agrobacterium
tumefaciens
de introducir ADN
en el genoma
de la planta permitió
desarrollar vectores
plasmídicos
basados
en el plásmido Ti

Agrobiotecnología

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
Ejemplos de vectores binarios

Mapa de restricción
de los plásmidos
pBIN19; pPZP111;
pMON10098;
pGreen0029.

Abreviaturas:
BI: borde izquierdo;
ori: origen de
replicación;
BD: borde derecho.

Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.

Transformación mediante cocultivo de
Agrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco

A B

Disco foliar

Co-cultivo con una

Explante inicial
bacteria desarmada
(hoja)
en medio líquido

C D

Co-cultivo en medio
sólido sin antibióticos

Planta transgénica
aclimatada en
invernadero
E F

Medio de inducción de
brotes con antibiótico y
Medio de enraizamiento con o
agente de selección
sin agente de selección
Sistemas de
transferencia • Ventajas
directa - Son considerados sistemas universales porque, al no
depender de organismos vectores, pueden aplicarse
de ADN a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las células del organismo vector

de los tejidos o plantas transgénicas

- Requieren construcciones más simples y pequeñas

- Son apropiados para estudios de expresión transitoria

• Desventajas
Agrobiotecnología - Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias
truncas del transgén y del vector en varios sitios del
Biobalística genoma de las células transformadas
y otros sistemas
de transferencia
directa de ADN - Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de
re-arreglos en los transgenes
La
transformación •Parámetros físicos y químicos que influyen
en la transferencia del ADN
por biobalística
- Método de aceleración de las micropartículas
depende de
factores físicos, - Naturaleza química y física, densidad y volumen
de las micropartículas
químicos
y biológicos - Naturaleza, preparación, adherencia y concentración

del ADN
- Vacío y distancias de bombardeo
- Diámetro de apertura de la placa de retención
- Número de bombardeos

Agrobiotecnología • Parámetros relacionados con la construcción

genética utilizada
Biobalística
y otros sistemas - Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
de transferencia
directa de ADN genes marcadores de selección
Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas

Acelerador de micropartículas PDS 1000/He 

por descarga de helio a alta presión

Modelo comercial actual

Medidor de presión de helio

Tubo de aceleración de gas

Interruptores de control

Medidor de vacío
Portador del disco
de ruptura

Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles
Cámara de
bombardeo

Células blanco

Soporte del
Soporte del blanco
tejido blanco

Válvula de medición
de helio

Controles del flujo

de aire y de vacío
Mecanismo de disparo de un cañón impulsado
por He a alta presión (PDS 1000/He)

Estado del disco de ruptura, macroproyectil

y malla de retención luego del
bombardeo
La pistola
Transformación genética de plantas in vivo
génica Helios usando una pistola génica Helios
permite la
transformación
de tejidos
in vivo

Agrobiotecnología

Biobalística
y otros sistemas
de transferencia
directa de ADN
Expresión transitoria del gen reportero uidA
en explantos bombardeados con micropartículas

A B C
Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf
Expresión transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un cañón PDS
1000 He  usando diferentes concentraciones de micropartículas. A: 200 µ g, B: 100 µ g y C: 30
µ g

A B
Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..
Expresión transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con una
pistola Helios  con y sin malla de difusión de micropartículas
La biobalística
- Transferencia de genes a células, tejidos y órganos
puede utilizarse
vegetales
con diversos
fines - Transferencia de genes a microorganismos y
organelas
experimentales
- Estudio de expresión transitoria

- Análisis de promotores y de delección de genes

- Estudio de mecanismos de expresión y regulación

de genes

- Estudio de infecciones virales

- Transferencia de ARN viral

Agrobiotecnología
- Estudio de vías metabólicas
Biobalística
y otros sistemas
de transferencia - Estudio del desarrollo de plantas
directa de ADN
Genes selectores para transformación de plantas

Gen de selección Producto genético Fuente Selección

nptII Neomicina fosfotransferasa Tn5 Kanamicina, G418,

paromomicina, neomicina

Ble Resistencia a bleomicina Tn5 y Streptoalloteichus Bleomicina, fleomicina

hindustanus

dhfr Dihidrofolato reductasa Plásmido R67 Metotrexato

cat Cloranfenicol acetil Fago p1Cm Cloranfenicol

transferasa

aphIV Higromicina fosfotransferasa E. coli Higromicina B

SPT Estreptomicina Tn5 Estreptomicina

fosfotransferasa

aacC3, aacC4 Gentamicin-3-N- Serratia marcescens; Gentamicina

acetiltransferasa Klebsiella pneumoniae

bar Fosfinotricin acetil Streptomices Fosfinotricina, bialofos

transferasa hygroscopicus

EPSP 5-enolpiruvilshikimato-3- Petunia hybrida Glifosato

fosfato sintasa
Genes reporteros usados en transformación de plantas

Genes reporteros Abreviatura Origen Detección

β -glucuronidasa gus/uidA E. coli Fluorométrico (cuantitativo)

o histoquímico (in situ),
no radiactivo

Proteína de fluorescencia GFP Aequorea victoria Fluorescencia,

verde no destructiva

Cloranfenicol Cat E. Coli Ensayo radiactivo

acetiltransferasa sensitivo, semicuantitativo
semi cuantitativo

Luciferasa Luc Photinus pyralis Luminiscencia

Luciferasa luxA, luxB Vibrio harveyi Luminiscencia

Expresión
del gen uidA
en Arabidopsis Tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enteros
thaliana de Arabidopsis thaliana mediante la reacción
histoquímica de la enzima β -glucuronidasa
luego de la infiltración con Agrobacterium
tumefaciens
A B C D

Agrobiotecnología
www.plantphysiol.org

Sistemas
de transformación
vegetal:
Agrobacterium
tumefaciens
Expresión
del gen GFP A B
en plantas
transgénicas
de Nicotiana
benthamiana
C

Agrobiotecnología

Sistemas La expresión del gen GFP produce color verde o amarillo bajo
de transformación
vegetal: iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido
Agrobacterium se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila.
tumefaciens
 Potencial económico de los metabolitos
secundarios

Agrobiotecnología

Cultivos
celulares
Cultivo
de tejidos y El metabolismo secundario regula
metabolismo Concepto
muchas de las relaciones
general
secundario de la planta con el medio circundante

• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente

relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no está asociada al crecimiento.
- Depende de condiciones determinadas de control hormonal.
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos
(raíces, tallos, hojas y glándulas).
- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente
compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos
y de órganos.

• Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones

Agrobiotecnología de estrés o enfermedad.
Cultivos - Factores bióticos
celulares - Factores abióticos
Las plantas
como fuente - Insecticidas - Fragancias - Medicinas
de metabolitos - Saborizantes - Antimicrobianos - Herbicidas
secundarios - Colorantes - Enzimas - Proteasas
de interés
comercial • Potencial
- 75 % de las nuevas estructuras químicas
descubiertas provienen de las plantas.

- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000

de las 250.000-300.000 especies vegetales
que se creen existentes en el planeta.

- 25 % de los medicamentos de las industrias

farmacéuticas son de origen vegetal.
Agrobiotecnología
- 75 % de la población mundial utiliza la medicina
Cultivos tradicional que consiste principalmente en
celulares
el uso de extractos provenientes de plantas.
 Natural Sources
CH3
OH

N
H COOCH3

N
Vincristine and vinblastine (anti- tumoral
H

CH3
extracted from leaves of Catharanthus

H3CO
N OCOCH3 roseus)
OH
R COOCH3

CH3- C - O O
OH

O O 3HC
CH3
Taxol (anti-tumoral, extracted from the
C - NH - CH - CH - C - O
O
bark of Taxus brevifolia)
OH H
OH O - C -CH3
C O O
O
 Biotechnological processes
OH O OH
Shikonin (anti-inflammatory, pigment
obtained by fermentation of Lithospermum
erythrorhizon cells)
OH O

Berberine ( antimicrobial, anti-inflammatory,

O

OCH
pigment obtained by fermentation of Coptis
3

japonica and Thalictrum minus )

OCH 3

O-Glc-Glc

OH
Ginsenosides (stimulant of the nervous
system obtained from hairy roots of Panax
ginseng )
Glc-Glc-O
Algunas de las medicinas más importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina, Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
escopolamina
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca Antineoplásico
acuminata
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local
Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico
Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico
Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico
Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico
Vinblastina, Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
vincristina
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Afrodisíaco
Rubiaceae
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia
Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico
Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante
Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emético
ipecacuana ipecacuanha
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
Producción - Independizarse de factores externos tales como:
de metabolitos cambios de temperatura, sequías, plagas,
variabilidad de la producción, factores políticos
secundarios y sociales, etc.
por cultivo
- Evitar la extinción de especies vegetales.
in vitro
de células - Disponer de condiciones controladas en el proceso
y órganos de producción y extracción.

vegetales: - Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos

¿por qué? mas cortos.

- Hacer viable la producción de compuestos

complejos con uno o más C quirales en forma más
económica respecto de la síntesis química

Agrobiotecnología - Posibilitar la obtención de nuevos compuestos

no presentes en la planta madre.
Cultivos
celulares
- Establecer procesos de biotransformación sólo
realizables por enzimas provenientes de plantas.
Procesos industriales

Tipo de compuesto Producto Compañía

Farmacéuticos Shikonina Mitsui Petrochemical Ind.

Berberina Mitsui Petrochemical Ind.
Sanguinarina Vigont Researol Lab.
Gingsenósidos Nitto Denko Co.
Taxol Phyton USA
Pigmentos Cartamina Kibun Kyoto University
Fragancias Geraniol Kanedo Co.
Citronerol Kanedo Co.
Saborizantes Vanillina Kanedo Co.
Depigmentadores Arbutina Mitsui Petrochemical Ind.
Viabilidad de
un proceso • Condiciones económicas:
para su - Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
escalado a
- Alto rendimiento y productividad del cultivo
nivel industrial comparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta entera

como fuente alternativa

• Parámetros principales:
- Productividad: g de producto/L/día

Agrobiotecnología - Concentración máxima de producto:

g de producto/L
Cultivos
celulares
- Rendimiento: g producto/g sustrato
 Estrategias para incrementar
la producción de metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Cultivos
celulares
Metodologías
utilizadas para
optimizar • Selección de especies vegetales apropiadas
la producción • Selección de líneas celulares mejoradas
de metabolitos
secundarios • Optimización de las condiciones de cultivo

• Agregado de precursores

• Tipo de cultivo: suspensiones, órganos

o células inmovilizadas

• Uso de elicitores microbianos

y estrés abiótico
Agrobiotecnología

Cultivos • Permeabilización y remoción in situ

celulares
Metodologías • Screening y selección de líneas sobreproductoras
utilizadas para
optimizar - Se facilita cuando el metabolito de interés es un
pigmento, ya que puede hacerse una selección
la producción visual.
de metabolitos - Es importante contar con un método rápido y sencillo
para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo,
secundarios ELISA).

• Optimización del medio de cultivo (variables más

ensayadas)

- Fuente de carbono
- Limitación en nitrógeno
- Limitación en fosfato
- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
- Relación C/N
Agrobiotecnología • Agregado de precursores
Cultivos
celulares - Bajo costo
- Baja toxicidad
- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica
Diferencias entre suspensiones de células vegetales
y de células microbianas

Caracterización Células Células Consecuencias para

microbianas vegetales cultivos a gran escala

Tamaño Células Agregados de Sedimentación rápida;

y morfología Individuales 10-200 µ m y sensibilidad a fuerzas de corte;
2-10 µ m de hasta 2 mm formación de gradientes;
de diámetro dificultad para tomar muestras

Velocidad Rápida; Lenta; td ~ 2-5 días Largos tiempos de proceso;

de crecimiento td ~ 1-2 h baja productividad

Densidad de Pequeña 5-20% Necesidad de grandes

inoculación cantidades de inóculo;
escalado más largo

Sensibilidad a Insensible Sensible / Bajas velocidades

fuerzas de corte Tolerante de agitación

Aireación Alta Baja Baja demanda de oxígeno:

fermentadores con baja
transferencia de oxígeno
Acumulación
del producto Extracelular Intracelular / Permeabilización;
a veces extracelular remoción in situ

Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.

Cultivos en
suspensión • Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inóculo

- Tamaño y agregación de las células

- Oxigenación

- Agitación

Agrobiotecnología

Cultivos
celulares
Cultivo de órganos: raíces transformadas
Propiedad
Forma de crecimiento
Patrón de crecimiento
Tiempo de duplicación
Biomasa final
(peso seco/L)
Background genético
Formación inicial de producto
Medio de crecimiento
Localización del producto
Tipo de proceso
Suspensiones Raíces transformadas
Células simples-agregados Red de ramificaciones
Desorganizado; cada célula División celular localizada;
puede dividirse y expandirse crecimiento linear con
ramificaciones laterales
15 h-días 36 h-días
30-60 g 30-60 g
Heterogéneo Euploide
Usualmente bajo Similares a la planta madre
Complejo; hormonas Simple, sales y azúcar
y vitaminas
Intracelular- extracelular Intracelular- extracelular
Batch; continuo, deben Batch o continuo, no hay
ser inmovilizadas necesidad de inmovilizar
Algunos
metabolitos Metabolito Género
secundarios Alcaloide
producidos Alcaloides piridínicos
Indoles
Nicotiana
Catharanthus
por raíces Tropano
Cinchona
Duboisia
transformadas Datura

Otros
Betalaina Beta
Sesquiterpenos Lippia
Artemisia
Poliacetilenos Coreopsis, Bidens
Tiofenos Tagetes

Glicósidos cardioactivos Digitalis

Antraquinonas Cassia
Saponinas Panax
Polyines Chaenactis
Lignanos Podophyllum
Agrobiotecnología Linum
Naftoquinonas Lithospermum
Esteroides Solanum
Cultivos
celulares

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Patrón de flujo de dos diseños de propulsor

Agitador de paletas planas o Rushton Agitador de paletas inclinadas

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Diseños alternativos para biorreactores
con agitación mecánica

Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Biorreactores para el cultivo de raíces
Bioreactor de lecho de goteo Bioreactor de lecho de niebla
con malla para inmovilizar a las raíces (nutrient mist reactor)
Inóculo
Salida de aire

Malla de
inmovilización Adición de nutrientes

peristáltica

Rotámetro
Filtro de aire

Bomba
Bomba de aire

Generador de niebla
Aire Aire Reservorio Intensidad Condensador
On Off de niebla
Cámara
Controlador
Bomba de cultivo

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Cultivo • Ventajas
de tallos
- Cultivos genética y bioquímicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis,
etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se
cumple).

• Desventajas
- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificación

Compuesto Planta
Agrobiotecnología
Piretrinas Chrysanthemum spp.
Cardenólidos Digitalis spp.
Cultivos Artemisinina Artemisia annua
celulares Aceites esenciales Mentha spp.
Aceites esenciales Pelargoium spp.
Elicitación

• Agentes bióticos

- Extractos de paredes de hongos o bacterias

- Acido araquidónico
- Quitosano
- Metil jasmonato

• Agentes abióticos

- Metales pesados
- Radiación UV
- Presión osmótica
Agrobiotecnología
- Ultrasonido
Cultivos
celulares
Liberación
del producto
al medio - DMSO

- Shock térmico

- Cambios de pH

- Limitación de fosfato y oxígeno

- Elicitación

- Detergentes y aceites de siliconas

Agrobiotecnología - Electropermeabilización
Cultivos
celulares
Remoción • Líquido-líquido:
de producto Compuestos inmiscibles en agua, como solventes
in situ orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico).
Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Compuestos miscibles en agua, como sales o soluciones

de polímeros (sistemas de dos fases acuosas).
Ejemplos: DEAE, PEG.

• Sólido-líquido:
La segunda fase es un material sólido como resinas u otros
absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

• Requerimientos:
- Autoclavables
Agrobiotecnología - No tóxicos
- Fácil separación del producto de interés
Cultivos de la segunda fase
celulares - No modificación del medio de cultivo
- Permanencia de las células en la fase acuosa
Adaptaciones para la extracción in situ del producto

Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado Un bioreactor de agitación por líquido

para operar con remoción in situ del producto. con loop externo
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar
raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5:
medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9:
filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Secuencia en la Selección de la planta por su contenido de metabolitos
optimización de secundarios para iniciar cultivos in vitro

un proceso para
la producción
Establecimiento de cultivos in vitro
de metabolitos
secundarios
Estabilización y selección de cultivos
in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberación al medio

Optimización de medio de cultivo para producción

por diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación,
liberación y remoción in situ
Agrobiotecnología

Cultivos
celulares Optimización en bioreactores: escalado
Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión,
en dos etapas. Extracción y purificación del producto
Estrategias
para modificar
el metabolismo
- Completar rutas metabólicas mediante
secundario inserción de genes heterólogos.
mediante
manipulación - Amplificar rutas normales.

genética - Bloquear rutas alternativas.

- Bloquear rutas normales.

- Modificar la regulación de rutas normales.

- Modificar los mecanismos de secreción

y exportación.
Agrobiotecnología
- Bloquear rutas de degradación.
Cultivos
celulares
Ingeniería metabólica del metabolismo secundario

Especie Enzima Producto Observaciones

Peganum harmala Triptofano decarboxilasa Serotonina Incremento de 10-20 veces

(suspensiones y raíces) (TDC) en producto

Hyosciamus muticus Hiosciamina-6-hidroxilasa Escopolamina Contenido de producto 4 veces

(raíces transformadas) (H6H) superior a planta control

Catharanthus roseus Triptofano decarboxilasa (TDC) Alcaloides indólicos Contenido de TIAs de 300 mg/L
(suspensiones) y estrictosidina sintasa (STR) (TIAs) comparado con control 50mg/L.
Líneas inestables

Catharanthus roseus ORCA3 (factor Alcaloides indólicos Incremento de la concentración de TIAs

(suspensiones) De transcripción) (TIAs) de 3 veces después de agregar
el precursor secologanina

Coptis japonica (S)-esculerina 9-O- Berberina Incremento del flujo hacia la producción
(suspensiones) metiltransferasa (SMT) de berberina de 15%

Mentha spp. Desoxixilulosa fosfato Aceites esenciales Incremento del 50% ene l contenido
(planta) reductoisomerasa (DXR) de aceites esenciales

Zea mays C1 y R (factores Antocianinas Producción de antocianinas y fenoles

(callos) de transcripción) que no se producían en los callos sin
transformar.
Ejemplos
de Ingeniería
metabólica en • Problemas
el metabolismo
secundario - Clonado de genes

- Estabilidad

- Compartimentalización

- Transporte

- Limitaciones y arquitectura
de la ruta metabólica
Agrobiotecnología
- Canales metabólicos
Cultivos
celulares
Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito
secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales
Producción de shikonina por suspensiones celulares
de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina
Yamasaki Plant Photo Gallery

• Planta entera
- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.

• Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción.
- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen
la producción de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Proceso para la producción de shikonina a partir de células
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Producción de taxol por Taxus spp

Schoepke Plant Image Gallery Taxol®

• Planta entera
- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años.
- La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.
- Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.

• Semisíntesis

- El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de

precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
- Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.
Conclusiones
• Aspectos bioingenieriles

- Diseño de bioreactores especiales para cultivos

de tejidos vegetales
- Instrumentación y control de los bioprocesos
- Diseño de bioreactores más económicos
- Métodos no letales para liberación
de los metabolitos secundarios
- Método adecuado para la remoción in situ

• Aspectos Biológicos

- Conocimiento de la regulación de las rutas

biosintéticas: enzimas y factores de transcripción
- Conocimiento de la regulación del transporte
Agrobiotecnología
y acumulación de los metabolitos secundarios
- Conocimientos de los mecanismos
Cultivos
celulares de degradación del producto
Expresión de proteínas heterólogas en plantas
(Molecular Farming)

•bajos costos de producción.

•tiempos menores para poner en el
mercado.
•abastecimiento ilimitado.
•procesamiento correcto de proteínas.
•seguridad.
Expresión de proteínas heterólogas en plantas
(Molecular Farming)

Fidelidad en la e
plantas.
Expresión de proteínas heterólogas en plantas
(Molecular Farming)

Plantas tran
Períodos más l
Fitorremediación Ventajas

• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas

extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas
contaminadas (10-20 % del costo de métodos tradicionales):

- las plantas emplean energía solar

- el tratamiento es in situ

• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más

rápida con plantas que con microorganismos.

• Es un método apropiado para descontaminar superficies

grandes o para finalizar la descontaminación de áreas
restringidas en plazos largos.

• Es una metodología con buena aceptación pública.

Agrobiotecnología
• Se generan menos residuos secundarios.
Fitorremediación
Fitorremediación
Limitaciones

• El proceso se limita a la profundidad de penetración

de las raíces o a aguas poco profundas.

• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente

contaminadas.

• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.

• La biodisponibilidad de los compuestos o metales

es un factor limitante de la captación.

• Deben considerarse potenciales contaminaciones

de la cadena alimentaria y napas de agua.

• Se requiere comprender mejor la naturaleza

Agrobiotecnología
de los productos de degradación (fitodegradación).
Fitorremediación
• Falta elaborar el marco regulatorio.
Biología de la • Captación por las raíces:
acumulación - Movilización de los metales

de metales • Quelación mediante fitosideróforos

• Unión a proteínas quelantes
en plantas • Acidificación por exudado de H+
- Captación por la raíz
• Via apoplástica
• Vía simplástica
• Transporte:
- Almacenamiento en raíz y exportación al tallo por xilema
- Transporte por xilema o redistribución por floema
- Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia:
- Captación celular limitada (evasión)
- Metabolismo resistente a metales pesados
Agrobiotecnología - Detoxificación por quelación, compartimentalización
o precipitación
Fitorremediación
Mecanismos más probables:
- Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+ , Zn2+ , Cu2+ )
- Precipitación como fitatos (Zn2+ )
Fitorremediación Tipos de plantas más utilizadas
Freatófitas
- Plantas de raíces profundas
(álamo, sauce, algodonero).
Pasturas
- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
Legumbres
- Permiten enriquecer el suelo en N2.

Acuáticas
- Permiten la degradación de contaminantes
en ciénagas artificiales.

Agrobiotecnología

Fitorremediación
Tipos de • Fitoextracción
Las plantas se usan para concentrar metales en las partes
fitorremediación cosechables (principalmente, la parte aérea).

• Rizofiltración
Las raíces de las plantas se usan para absorber, precipitar y
concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos
contaminados.

• Fitoestimulación
Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo
de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

• Fitoestabilización
Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la
movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas
subterráneas o al aire.

• Fitotransformación
Agrobiotecnología - Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan,
almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar
Fitorremediación subproductos no tóxicos o menos tóxicos.

- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales

pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera
con la transpiración.
Tipos de fitorremediación
Tipo Proceso involucrado
Fitoextracción Las plantas se usan para concentrar
metales en las partes cosechables
(principalmente, la parte aérea).
Rizofiltración Las raíces de las plantas se usan para
absorber, precipitar y concentrar metales
pesados a partir de efluentes líquidos
contaminados.
Fitoestabilización Las plantas tolerantes a metales se usan
para reducir la movilidad de los mismos y
evitar el pasaje a napas subterráneas o al
aire. Contribuyen a estabilizar el suelo.
Fitoestimulación Se usan los exudados radiculares para
promover el desarrollo de
microorganismos degradativos (bacterias y
hongos).
Fitovolatilización Las plantas captan y modifican metales
pesados o compuestos orgánicos y los
liberan a la atmósfera con la transpiración.
Fitodegradación Las plantas acuáticas y terrestres captan,
almacenan y degradan compuestos
orgánicos para dar subproductos no
tóxicos o menos tóxicos.
Contaminación tratada
Cd2+ ,Co2+ ,Cr2+ ,Ni2+ ,Hg2+ ,Pb2+ ,Se2+ ,Zn2+ .
Cd2+ ,Co2+ ,Cr2+ ,Ni2+ ,Hg2+ ,Pb2+ ,Se2+ ,Zn2+ .
Lagunas de deshecho de yacimientos mineros.
Propuesto para fenólicos y compuestos
clorinados.
Hidrocarburos poliaromáticos, benceno, tolueno,
etil benceno, xileno, hidrocarburos del petróleo,
perciorato, atrazina, ataclor, bifenilos
policlorinados, otros compuestos orgánicos.
Hg2+ , Se2+ y solventes clorinados
(tetraclorometano y triclorometano).
Explosivos (TNT, DNT, RDX, nitrobenceno, ácido
pícrico, nitrotolueno, nitrometano, nitroetano).
Atrazina, solventes clorinados, bromuro de metilo,
tetrabromoeteno, tetracloroetano, DDT, pesticidas
fosfatados, bifenoles policlorinados, fenoles y
nitritos.
Tomado de McCutcheon, PBI Bulletin 1998.