Batista, Luiza da Silva, Diego Plazzotta, Renzo Sanguinetti, Yuliana Villanueva, Esteban

CBCC V

RESUMEN

La Insulina estimula el transporte de Glucosa. En gran parte a travs de la translocacin del transportador de Glucosa sensible a la Insulina (GLUT- 4). Microinyecciones de clulas individuales de los Adipocitos 3T3-L1, e Inmunofluorescencia de las protenas de GLUT- 4, determinan que: La inhibicin del p21 ras endgeno, o la inyeccin de p21 ras oncognica NO tienen efectos sobre la translocacin de GLUT- 4 estimulada por insulina.

Por otra parte

Microinyecciones de anticuerpos anti-fosfotirosina. Inhibicin de la Fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-quinasa) por microinyeccin de GST-p85 de fusin a SH2. (GST: Glutatin S-transferasa/p85: subunidad 85 de la protena).
determinan

LA NOTABLE INHIBICIN DEL EFECTO BIOLGICO DE LA INSULINA

Lo anterior sugiere que: p21 ras/Protena activada por mitgenos quinasas no est involucrada, mientras que la fosforilacin de la Tirosina y la estimulacin de PI3-quinasa, son los componentes crticos de esta va de sealizacin.

INTRODUCCIN

La Insulina tiene efectos pleiotrpicos biolgicos: Regula la produccin heptica de Glucosa (Glu). Regula la estimulacin de la captacin de Glu de los tejidos diana, debido a la translocacin de los GLUT- 4, de un pool vesicular intracelular a la membrana plasmtica, donde pueden captar a la Glu. Mediada por una va de sealizacin divergente de la va oncognica, que puede utilizar en parte, distintas molculas de sealizacin.

VIA DE SEALIZACIN METABLICA DE LA INSULINA

Va metablica de sealizacin:
defectos en la misma, pueden causar:

Diabetes Mellitus tipo II Obesidad Sndrome de ovario poliqustico

-RESISTENCIA A LA INSULINA -DISMINUCIN EN LA FUNCIN DE GLUT- 4

La Insulina causa un aumento en la captacin de Glu celular. Para evaluar la va, se utiliz: - Microinyeccin de clulas individuales de los adipocitos 3T3-L1. - Microscopa de inmunofluorescencia de las protenas GLUT- 4; para evaluar la transmembrana de la va de sealizacin que conduce a la translocacin de GLUT- 4 estimulada por la insulina.

PROCEDIMIENTO EXPERIMETAL
MATERIALES: Insulina porcina Anticuerpos policlonales anti-GLUT-4 (F349) Anticuerpos monoclonales anti-GLUT-4 (1F8) Anticuerpos policlonales anti-c-Fos Anticuerpos monoclonales anti-p21 Ras (Y13-259) Anticuerpo policlonal anti-Shc Anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY20) Recombinante T24 Ras (oncognico) Protena N17 Ras (mutante dominante negativo) Protena GST-p85 de fusin a SH2 Ig G de ovejas Isotiocianato de fluorescena /Tetrametilrodamina Isotiocianato (colorantes) AMCA (cido 7-amino-4-metilcumarina-3-actico)

CULTIVO CELULAR Y MICROINYECCIN

Se cultivaron fibroblastos Rat-1 (sobre-expresan el receptor de insulina humana de tipo salvaje: HIRcB) 3T3-L1 fueron cultivados y mantenidas con DMEM (Dulbecco's Modified

Eagle Medium), con 50 un/ml de Penicilina, 50 mg/ml de Estreptomicina, y 10% de suero fetal bovino (FCS) en un 10% de CO2 Las clulas crecieron durante dos das, y luego se adicion Isobutilmetilxantina (500 M), Dexametasona (25M), y la Insulina (4mg/ml) durante tres das. El cultiv se produjo por aproximadamente 10 das, hasta que las clulas se diferenciaran totalmente. Se tripsinizaron los adipocitos (antes del experimento) y se resembraron en cubreobjetos de vidrio lavados con cido. Las clulas fueron cultivadas en el mismo medio s/suero durante 2 hs. Se microinyectaron diversos reactivos. Todos se disolvieron en un buffer: fosfato de Na 5mM (PH 7,2),100mM KCl. Las protenas N17 Ras, T24 Ras y GST-p85 SH2 fueron co-inyectadas con 10 mg/ml de Ig G de oveja con fines de deteccin. Las clulas se recuperan durante 1 hora, antes de la tincin.

INMUNOTINCIN Y MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA

GLUT-4 tincin de protena En cada clula microinyectada AMCA-positva se evalu la presencia de GLUT-4 en la membrana plasmtica, asociada a manchas. (ver figura 1) TINCIN DE LA PROTENA c-Fos (protooncogn) Las clulas se tien con anti-anticuerpos c-Fos (1/100) durante 90 min a 37 0C, seguido de la incubacin con el anticuerpo Ig G rodamina-conjugada.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Adipocitos 3T3-L1 diferenciados se microinyectaron con distintos reactivos, seguidos por la estimulacin de la insulina. A continuacin, se observ la translocacin de GLUT-4 a la superficie celular mediante microscopa de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-GLUT-4 seguidos por un segundo anticuerpo: fluorescena-conjugada. Figura 1: A y B, muestran un campo que contiene adipocitos antes (A) y despus (B) de la estimulacin de la insulina. Sin la estimulacin de la insulina, la tincin de GLUT-4 es casi exclusivamente en el compartimento intracelular con discreta tincin perinuclear. Despus de la estimulacin de la Insulina, se ve una intensa coloracin uniformemente distribuida en la superficie celular, acompaada de una disminucin de la tincin de GLUT-4 intracelular, esto evidencia que las protenas GLUT-4 teidas del pool vesicular intracelular se translocaron a la membrana plasmtica. La translocacin se produce con una evolucin en tiempo (Fig. 1C) y curva dosis-respuesta (1D) tpica del transporte de Glu estimulado por la insulina.

FIGURA 1

Visualizacin de la translocacin de GLUT-4 estimulada por la Insulina en los adipocitos 3T3-L1

A: Tratados sin insulina. B: Tratados con insulina 10 ng/ml, durante 20 min. Ambos campos se tieron con anticuerpos anti-GLUT4 (1F8), luego se incubaron con un conjugado anti-anticuerpos Ig G-fluorescena.

C: Curso temporal de la translocacin de GLUT-4: Los adipocitos en cubreobjetos se estimularon con 10 ng/ml de insulina para diferentes tiempos y se tien de GLUT-4. D: Respuesta de la translocacin de GLUT-4 a la dosis de Insulina: Adipocitos en cubreobjetos fueron estimulados con las concentraciones de insulina indicadas durante 20 min y se tieron de GLUT-4. El % de clulas positivas para la translocacin de GLUT4 se calcul contando por lo menos 100 clulas en cada punto.

EXPERIMENTO 2

OBJETIVOS:

- Aclarar la cascada de sealizacin que media el efecto de la insulina sobre la translocacin de GLUT-4. - Verificar si alguna de las seales de la va mitognica participan en la translocacin de GLUT-4, mediante la microinyeccin en adipocitos de una serie de reactivos Rasrelacionados. - Demostrar si la divergencia de las vas mitognica y metablica se encuentra o no en el punto de sealizacin proximal a la formacin de p21 Ras-GTP (activacin de p21 ras).

VIA DE SEALIZACIN MITOGNICA DE LA INSULINA

Exp. 2 PROCEDIMIENTO

Microinyeccin de reactivos Ras-relacionados en los adipocitos 3T3-L1. Reactivos utilizados: - N17 ras - T24 ras - anticuerpos anti-p21 ras - anticuerpo anti-Shc Evaluar los efectos de cada reactivo por separado, mediante grfico y tincin, utilizando la coloracin de GLUT4 y tincin de c-Fos.

RESULTADOS
Ig G= CONTROL N17= No ejerce ningn efecto sobre la insulina basal y tampoco sobre la translocacin de GLUT4. Anticuerpos anti-p21 ras= Sin efectos. T24 ras= No induce la translocacin de GLUT4, pero s la expresin de las protenas cFos (vase comparando con Fig. 3 - CG). Anticuerpo anti-Shc= No tiene efecto sobre la translocacin; pero si sobre la sntesis de ADN.

Figura 2. Barras blancas: clulas estimuladas en ausencia de Insulina. Barras sombreadas: clulas estimuladas en presencia de Insulina (10 ng/ml durante 20 min).

RESULTADOS
Contraste de fase

- Figura 3
- T24 Ras es microinyectada en los adipocitos; se evaluaron sus efectos sobre la expresin de la protena c-Fos y la translocacin de GLUT4 simultneamente. - AD, se microinyectaron con IgG de oveja (10 mg/ml) control. -EH, se microinyectaron con T24 Ras (2 mg/ml) + IgG de oveja (10 mg/ml). - Las clulas se tieron de GLUT4 e IgG inyectada, seguida de tincin de c-Fos.

Manchas de IgG, lo que demuestra las clulas inyectadas

Manchas de c-Fos

Tincin GLUT4

DISCUSIONES
Los reactivos Ras-relacionados no tuvieron efectos sobre la insulina o la translocacin de GLUT4, o sea que la inhibicin de la actividad Ras endgena mediante distintos anticuerpos anti-ras no afectaron la medida en que GLUT4 se transloca o la respuesta a la insulina del evento translocacin. T24 Ras es una protena constitutivamente activa que estimula los efectos aguas abajo de p21 ras-GTP, y causa una marcada induccin de la protena c-Fos (figura 3-CG). La va de sealizacin que conduce a la expresin de c-Fos fue activada por la microinyeccin de T24 Ras, pero la estimulacin de la misma no influy en la translocacin de GLUT4 (figura 3-DH). En suma, la activacin de p21 ras no es ni necesaria ni suficiente para la translocacin del GLUT4, esto indica que la ruta metablica de la mediacin de este efecto biolgico se desva de la ruta de sealizacin mitognica proximal a la activacin de p21 ras.

EXPERIMENTO 3

OBJETIVOS:
- Evaluar la relevancia de la PI3-K en los efectos metablicos de la Insulina. - Evaluar el papel de la fosforilacin de la Tirosina en la va metablica.

Exp. 3 - PROCEDIMIENTO

Microinyeccin de la protena de fusin GST-p85 SH2 en adipocitos 3T3-L1. Microinyeccin de anticuerpos anti-fosfotirosina en adipocitos 3T3-L1. Evaluacin de los efectos mediante grfico.

RESULTADOS
IgG= IgG de oveja (10mg/ml) CONTROL. p85 SH2= IgG de oveja (10mg/ml) + GST- 85 SH2 (12mg/ml). pY 20= anticuerpo antifosfotirosina (5mg/ml).

Figura 4. Barras blancas: clulas estimuladas en ausencia de Insulina. Barras sombreadas: clulas estimuladas en presencia de Insulina (10 ng/ml durante 20 min). - Por ltimo las clulas se tien de GLUT4.

DISCUSIONES

La microinyeccin de la protena GST SH2-p85 inhibe la translocacin de GLUT4 estimulada por la insulina en un 75%. Se verifica la especificidad del efecto anterior ya que la protena GST SH2-Shc utilizada en experimentos anteriores no afect la translocacin de GLUT4. El anticuerpo anti-fosfotirosina inhibe la translocacin de GLUT4, esto indica la necesidad de fosforilacin de la Tirosina (Y), as como la participacin de la PI3-K en este evento.

VIAS DE SEALIZACIN METABLICA Y MITOGNICA DE LA INSULINA

CONCLUSIONES

El informe demostr que la va del Ras, componente crtico de sealizacin mitognica, no es necesario para la translocacin de GLUT4 estimulada por la insulina. Se evidenci la divergencia de los eventos de sealizacin metablica y mitognica. La PI3-K es una molcula de acoplamiento necesario, activada por la seal de fosforilacin de la Tirosina generada por el receptor de insulina, que media el transporte de glucosa mediante la translocacin de los GLUT-4.